熒光定量PCR的原理及應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及其應(yīng)用該基因序列含有如下酶切位點(diǎn)：NdeI,SfiI,EcoRI前18個(gè)堿基序列ATGFFFFFFFFFFFFFFF后18個(gè)堿基序列RRRRRRRRRRRRRRTAA如何設(shè)計(jì)載體引物？熒光定量PCR儀的應(yīng)用基礎(chǔ)研究中基因表達(dá)豐度的測(cè)定；差異基因的表達(dá)檢測(cè)，基因型分析；臨床醫(yī)療領(lǐng)域病原體的檢測(cè)和基因診斷：包括特定基因的檢測(cè)、細(xì)菌和病毒等病原體的檢測(cè)；環(huán)境監(jiān)測(cè)，包括水質(zhì)、空氣的污染檢驗(yàn)；檢驗(yàn)檢疫工作：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因作物的檢驗(yàn)；法醫(yī)的遺傳學(xué)鑒定；PCR的反應(yīng)過程CycleFluorescence實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（Real-timeQ-PCR

）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)反應(yīng)體系中未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的三個(gè)概念增長(zhǎng)曲線

(primarycurve)熒光閾值（threshold)CT值(CycleThreshold)增長(zhǎng)曲線反映熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系CycleFluorescence域值：PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值。熒光域值（Threshold）的設(shè)定Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，CT值越?。荒０錎NA的起始拷貝數(shù)越少，CT值越大。一般正常的CT值范圍在15-35之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。

熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

SYBRGreen?I優(yōu)點(diǎn)：使用方便，可以應(yīng)用于不同的模板靈敏，便宜缺點(diǎn)：與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，但可以通過熔解曲線進(jìn)行辨別熔解溫度(TM值)Tm值：50%DNA變成單鏈時(shí)的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長(zhǎng)度、GC含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性。MELTCURVEANALYSISRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性，在病原微生物特異性檢測(cè)上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性好缺點(diǎn)：只適合于一種特異目標(biāo)的檢測(cè)，相對(duì)價(jià)格略高雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線查詢目的基因序列

選擇合適的熒光標(biāo)記方法選染料法則購買SyBrGreenI或相應(yīng)試劑盒；探針法則設(shè)計(jì)并合成熒光探針

設(shè)計(jì)特異引物或探針引物設(shè)計(jì)的一般原則：產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-300bp之間產(chǎn)物GC含量在50-60%之間引物的GC含量在50-60%之間，熔解溫度在55-65℃之間應(yīng)避免引物中有連續(xù)的G或C，但推薦在引物的末端含有G或C

Primer5.0/Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)時(shí)先對(duì)普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在條帶特異的情況下才能采用染料法進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)注意模板濃度：在普通PCR基礎(chǔ)上可以稀釋10~100倍引物濃度：0.4~0.9μM（一般略低于PCR引物量）熒光物質(zhì)濃度：按說明書操作，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化加樣準(zhǔn)確性：避免微小加樣熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線模板

PlasmidDNA

目的片段在PlasmidDNA中很易被擴(kuò)增，可以適當(dāng)稀釋

TotalDNA

目的片段在TotalDNA中豐度相對(duì)較低，因此TotalDNA量要略高于PlasmidDNA

cDNA

以cDNA為模板時(shí)一般將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋10~50倍后作模板熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線熒光定量PCR反應(yīng)靈敏，微小差異都能被反映，實(shí)驗(yàn)中要避免核酸污染，尤其是避免PCR產(chǎn)物污染。試劑反復(fù)凍融對(duì)實(shí)驗(yàn)也有影響，各組分采用少量分裝保存低濃度模板反復(fù)凍融容易降解，少量分裝保存定量方法絕對(duì)定量相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度logN0=-CtlogE+logN絕對(duì)定量——未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品：含有目的片段的濃度已知的核酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，一般選取4-5個(gè)點(diǎn)（多于5個(gè)更好），被選點(diǎn)的模板濃度范圍要包括待測(cè)樣本濃度相對(duì)定量——在一定樣本中靶基因相對(duì)于另一參照樣本的量的變化

只需要了解相對(duì)于參照樣本目的基因的表達(dá)量的變化量，而不需要確切的知道基因的表達(dá)量具體是多少，采用相對(duì)定量即可。比較的依據(jù)是實(shí)驗(yàn)時(shí)不同樣本的總核酸模板一致用表達(dá)量基本恒定的看家基因作為內(nèi)參照來體現(xiàn)上樣模板的量相對(duì)定量方法比較CT法（△△CT）前提：每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，靶基因和看家基因的擴(kuò)增效率基本一致雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法利用兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到目的基因及持家基因的表達(dá)量樣本目的基因表達(dá)量=目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得值持家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得值目標(biāo)基因與持家基因擴(kuò)增效率差別舉例

對(duì)于每一個(gè)稀釋梯度，都用GAPDH和c-myc引物進(jìn)行擴(kuò)增。計(jì)算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通過cDNA濃度梯度的log值對(duì)△CT值作圖，如果所得直線斜率絕對(duì)值接近于0，說明目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增效率相同，就可以通過△△CT方法進(jìn)行相對(duì)定量。

KennethJ.LivakandThomasD.Schmittgen,METHODS25,402–408(2001)相對(duì)定量方法二——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

當(dāng)兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)效率不同或者不方便證明的時(shí)候，