熒光探針；過氧亞硝基陰離子；響應(yīng)機(jī)理；活性氧

中文摘要在最近的這幾年里，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，小分子熒光探針由于具有較高的靈敏度、選擇性好、生物兼容性良好等特點(diǎn)，慢慢地進(jìn)入了科學(xué)研究者的視野?？蒲腥藛T也意識到利用這種小分子熒光探針可以進(jìn)入活生物體中對目標(biāo)分子進(jìn)行識別和影像，以及對目標(biāo)分子的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)控。因此，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、環(huán)境分析和生物分析領(lǐng)域，特別適用于對樣品的實(shí)時(shí)監(jiān)測和生物熒光成像，而且在研究生命歷程、生命疾病、疾病的診斷方面發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢，也給科研人員帶來了一些重要啟示。目前，設(shè)計(jì)并合成出能特異性追蹤生物體內(nèi)目標(biāo)分子的熒光探針已經(jīng)成為科研工作者的一個(gè)重要研究課題及關(guān)注熱點(diǎn)，熒光探針也慢慢地成為研究生命領(lǐng)域的一種重要技術(shù)。過氧亞硝基陰離子（ONOO-）是生命系統(tǒng)中內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧（ROS）之一，可以在各種生理和病理?xiàng)l件下在線粒體中產(chǎn)生，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，并且還表現(xiàn)出抗微生物和抗菌活性。最近的證據(jù)表明，ONOO-與阿爾茨海默病，關(guān)節(jié)炎，癌癥，自身免疫和炎癥性疾病以及其他疾病有關(guān)。由于缺乏有效的方法來觀察生命系統(tǒng)中ONOO-，所以科學(xué)家們也難以理解由ONOO-所引起的一系列疾病。熒光探針的出現(xiàn)很好地解決了這一難題。ONOO-熒光探針分子由于其選擇性好、靈敏度高、對樣品無破壞性，已經(jīng)成為實(shí)時(shí)檢測ONOO-的重要工具及手段。然而，設(shè)計(jì)并合成出選擇性好且靈敏度高的ONOO-熒光探針已成為研究焦點(diǎn)；因此，本課題在查閱各種文獻(xiàn)及資料的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成出一種以6-羥基-2-萘甲醛為反應(yīng)原料的ONOO-熒光探針，也通過各種儀器分析得出該探針能有效排除其他ROS的干擾，對ONOO-具有良好的選擇性；與ONOO-反應(yīng)能在紫外-可見光吸收光譜中370nm左右處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰且吸光度比較大；與ONOO-反應(yīng)后熒光響應(yīng)很強(qiáng)但由于自身熒光強(qiáng)，導(dǎo)致靈敏度并不高，這有待以后進(jìn)一步改進(jìn)。關(guān)鍵詞：熒光探針；過氧亞硝基陰離子；響應(yīng)機(jī)理；活性氧ABSTRACTInthepastfewyears,withtheadvancementanddevelopmentofscienceandtechnology,smallmoleculefluorescentprobeshaveslowlyenteredthefieldofscientificresearchbecauseoftheirhighsensitivity,goodselectivityandgoodbiocompatibility.Researchersarealsoawarethattheuseofthissmallmoleculefluorescentprobecanenterthelivingorganismtoidentifyandimagethetargetmolecule,aswellasmonitorthedynamicchangesofthetargetmolecule.Therefore,thetechnologyiswidelyusedinthefieldsofchemicalanalysis,environmentalanalysisandbioanalysis,especiallyforreal-timemonitoringofsamplesandbio-fluorescenceimaging,andithasgreatadvantagesinthestudyoflifehistory,lifediseases,anddiseasediagnosis.Broughtsomeimportantrevelationstoresearchers.Atpresent,designingandsynthesizingfluorescentprobesthatcanspecificallytracktargetmoleculesinorganismshasbecomeanimportantresearchtopicandfocusofresearchers.Fluorescentprobeshavegraduallybecomeanimportanttechnologyinthefieldofliferesearch.Peroxynitrite(ONOO-)isoneoftheendogenouslyproducedreactiveoxygenspecies(ROS)inthelivingsystemandcanbeproducedinmitochondriaundervariousphysiologicalandpathologicalconditions,whichplaysanimportantroleinsignaltransduction.Andalsoexhibitsantimicrobialandantibacterialactivity.RecentevidencesuggeststhatONOO-isassociatedwithAlzheimer'sdisease,arthritis,cancer,autoimmuneandinflammatorydiseases,andotherdiseases.BecauseofthelackofeffectivemethodstoobserveONOO-inthelivingsystem,itisdifficultforscientiststounderstandaseriesofdiseasescausedbyONOO-.Theemergenceoffluorescentprobeshassolvedthisproblemwell.ONOO-fluorescentprobemoleculeshavebecomeanimportanttoolandmeansforreal-timedetectionofONOO-duetotheirgoodselectivity,highsensitivityandnon-destructivenesstosamples.However,thedesignandsynthesisofselectiveandsensitiveONOO-fluorescentprobeshasbecomethefocusofresearch;therefore,basedonthereviewofvariousliteraturesandmaterials,thisprojectdesignedandsynthesizeda6-hydroxy-2-NaphthaleneformaldehydeistheONOO-fluorescentprobeofthereactionrawmaterial.ItisalsoanalyzedbyvariousinstrumentstofindthattheprobecaneffectivelyexcludeotherROSinterference,andhasgoodselectivitytoONOO-;andONOO-reactiveenergyinultraviolet-visiblelightAnewabsorptionpeakappearedatabout370nmintheabsorptionspectrumandtheabsorbancewasrelativelylarge.ThefluorescenceresponsewasstrongaftertheONOO-reaction,butthesensitivitywasnothighduetothestrongself-fluorescence,whichneedsfurtherimprovement.KeyWords：FluorescentProbe；Peroxynitrite；ResponseMechanism；ReactiveOxygenSpecies緒論1.1引言隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家們致力于研究人類的生命歷程，對于人體生命系統(tǒng)的微觀世界越來越著迷，通常會采用各種工具或手段更直觀地觀察生命系統(tǒng)中微觀世界的生理變化。近幾年來，熒光探針的快速發(fā)展給科研人員帶來了啟發(fā)，小分子熒光探針由于具有較高的靈敏度、選擇性好、生物兼容性良好等特點(diǎn)，慢慢地進(jìn)入了科學(xué)研究者的視野?？蒲腥藛T也意識到利用這種小分子熒光探針可以進(jìn)入活生物體中對目標(biāo)分子進(jìn)行識別和影像，以及對目標(biāo)分子的動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)控。因此，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、環(huán)境分析和生物分析領(lǐng)域，特別適用于對樣品的實(shí)時(shí)監(jiān)測和生物熒光成像，而且在研究生命歷程、生命疾病、疾病的診斷方面發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢，也給科研人員帶來了一些重要啟示。目前，設(shè)計(jì)并合成出能特異性追蹤生物體內(nèi)目標(biāo)分子的熒光探針已經(jīng)成為科研工作者的一個(gè)重要研究課題及關(guān)注熱點(diǎn)，熒光探針也慢慢地成為研究生命領(lǐng)域的一種重要技術(shù)。過氧亞硝基陰離子（ONOO-）是生命系統(tǒng)中內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧（ROS）之一，可以在各種生理和病理?xiàng)l件下在線粒體中產(chǎn)生，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，并且還表現(xiàn)出抗微生物和抗菌活性。過氧亞硝基陰離子（ONOO-）代謝產(chǎn)物為羥基自由基和二氧化氮自由基。在生物系統(tǒng)中，ONOO-的半衰期為10-20ms。通過離子通道，它可以隨意通過生物膜。在細(xì)胞中產(chǎn)生的ONOO-可以通過氨基酸殘基中的硫醇氧化，絡(luò)氨酸的硝化，蛋氨酸的氧化，色氨酸的氧化和硝化來修飾蛋白質(zhì)并改變它們的活性，從而損傷核酸DNA、蛋白質(zhì)和脂類，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最近的證據(jù)表明，ONOO-與阿爾茨海默病，關(guān)節(jié)炎，癌癥，自身免疫和炎癥性疾病以及其他疾病有關(guān)。因此，用于檢測具有高生物相容性和位點(diǎn)特異性的ONOO-的選擇性和靈敏方法的開發(fā)將非常重要并且有助于闡明ONOO-的生物學(xué)作用。ONOO-熒光探針分子由于其選擇性好、靈敏度高、對樣品無破壞性，已經(jīng)成為實(shí)時(shí)檢測ONOO-的重要工具及手段。然而，設(shè)計(jì)并合成出選擇性好且靈敏度高的ONOO-熒光探針已成為研究焦點(diǎn)之一。1.2熒光原理簡介熒光和磷光一樣，都是光致發(fā)光所產(chǎn)生的冷光。產(chǎn)生過程如圖1.1所示，磷光材料處于基態(tài)（S0），當(dāng)用特定波長的光照射時(shí)電子會吸收能量會通過非輻射躍遷系間竄越（ISC）回到第一激發(fā)三重態(tài)（T1），再經(jīng)過振動弛豫（VT）回到最低能級的第一激發(fā)三重態(tài)（T1），通過輻射躍遷釋放光子回到基態(tài)（S0）然而，熒光卻不一樣，電子會吸收能量并躍遷到激發(fā)態(tài)，處于高能量激發(fā)態(tài)的電子很快的通過非輻射躍遷振動弛豫（VT）和內(nèi)轉(zhuǎn)化（IC）的方式回到第一單重激發(fā)態(tài)（S1），然后通過輻射衰變釋放出光子回到基態(tài)（S0）。圖1.1熒光和磷光產(chǎn)生過程示意圖1.3熒光探針的特性在一般情況下，熒光探針大多數(shù)應(yīng)用于生物體內(nèi)，因此，理想狀態(tài)下的熒光探針應(yīng)具備以下特征：第一，熒光探針無毒無害，pH與生物體相近且具有生物相容性；第二，熒光探針不能干擾生物體，不能影響其正常功能的運(yùn)行；第三，探針?biāo)l(fā)出的熒光要有區(qū)分度，不能與生物體的背景熒光混淆。然而，在探針的標(biāo)記過程中，生物熒光探針的熒光特性會受到生物學(xué)主體的許多因素的干擾。另外，熒光探針的引入將不可避免地對檢測系統(tǒng)的原始狀態(tài)產(chǎn)生或多或少的影響。例如，如果在用熒光染料標(biāo)記后每種抗體結(jié)合超過四個(gè)熒光基團(tuán)，則抗體的親和力通常會降低。1.3.1熒光探針的選擇原則①熒光的定性與定量當(dāng)進(jìn)行定性實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，應(yīng)更多的選擇單波長激發(fā)探針；但是，進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，則應(yīng)選擇雙波長激發(fā)比率型探針。②熒光探針的特異性與毒性因?yàn)樘结樧饔糜谏矬w內(nèi)，應(yīng)盡可能選擇無毒或低毒性的和高特異性的探針。但是并非所有熒光探針都是特異性的，一般具有特異性的熒光探針都有以下特征：其熒光團(tuán)與目標(biāo)分子是具有特異性識別作用的配體或者是化學(xué)官能團(tuán)。通常包括抗原-抗體，生物素-抗生物素，酶-底物，葉酸-葉酸受體等。③熒光探針適用的pH通常，熒光探針應(yīng)適合于生理?xiàng)l件下的pH環(huán)境要求。當(dāng)探針在非生理?xiàng)l件下使用時(shí)，應(yīng)根據(jù)pH要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，在制備溶液時(shí)也應(yīng)注意這一點(diǎn)。④激發(fā)波長和發(fā)射波長由于電子在躍遷期間吸收或發(fā)射的能量會受到電子能級的限制，所以只能吸收或者發(fā)射特定波長范圍內(nèi)的光。激發(fā)波長主要在近紫外或可見光區(qū)域內(nèi)，發(fā)射波長主要在可見光區(qū)域內(nèi)，所以激發(fā)波長和發(fā)射波長決定了光源的選擇。例如，如果染料的激發(fā)波長在紫外區(qū)域，則必須使用紫外光源。最常用的光源是汞燈（主峰為366mm、405nm，436mm，546nm和575nm），氙燈（連續(xù)光），氬離子激光器（458m、488nm和514nm），氬-氪激光器（488mm，568nm和647m）和氦-氖激光器（543nm，594nm和633nm）。⑤熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度的大小決定了探針檢測的靈敏度高低，由探針的摩爾吸光系數(shù)和熒光的量子產(chǎn)率共同影響，當(dāng)條件在確定的情況下，兩者都為定值。當(dāng)探針與目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，其量子產(chǎn)率值應(yīng)大于或者接近0.4，否則沒有任何有效的價(jià)值。⑥熒光壽命分子處于激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間，稱為熒光壽命。探針極長的熒光壽命對于高靈敏度的檢測有著重要作用。⑦光穩(wěn)定性為了有效提高熒光信號的強(qiáng)度可以適當(dāng)增加激發(fā)光的強(qiáng)度，但光強(qiáng)度超過一定的極限會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。對于熒光顯微鏡，出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象會嚴(yán)重影響到測量結(jié)果，為此，增加檢測探針的靈敏度可以在有效提高熒光強(qiáng)度的同時(shí)，降低光強(qiáng)度，避免出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。1.4小分子熒光探針的簡介1.4.1小分子熒光探針的結(jié)構(gòu)一般來說，小分子熒光探針由三部分組成：接受體、連接基團(tuán)（中繼體）和熒光團(tuán)。接受體作用于目標(biāo)分子，負(fù)責(zé)追蹤識別目標(biāo)分子；連接基團(tuán)相當(dāng)于一個(gè)連接臂，負(fù)責(zé)把接受體與熒光團(tuán)連接起來；熒光團(tuán)是一個(gè)重要的部分，作為一個(gè)光學(xué)信號的信號源，對識別作用做出響應(yīng)并且發(fā)出熒光信號。檢測機(jī)制是通過小分子熒光探針與靶分子的相互作用來改變熒光光譜，從而達(dá)到檢測目標(biāo)化合物的目的。這些變化包括熒光壽命，熒光激發(fā)和發(fā)射波長，熒光強(qiáng)度，熒光共振/各向異性等。如圖1.2所示，目前大多數(shù)的有機(jī)小分子熒光探針都是以這種模式構(gòu)建。圖1.2小分子熒光探針構(gòu)建示意圖依據(jù)上述的設(shè)計(jì)原理，再根據(jù)接受體與底物類別的不同可以分為三類。第一類，通過配位作用，探針分子的接受體識別底物目標(biāo)分子，生成配合物，導(dǎo)致影響探針分子的光學(xué)性質(zhì)（圖1.3a）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這種作用包括靜電吸引，范德華力，配位鍵，氫鍵，偶極-偶極相互作用等。在設(shè)計(jì)熒光探針的初期，就是使用這種弱相互作用來改變探針分子的性質(zhì)（波長，強(qiáng)度，熒光壽命）。這種探針的優(yōu)點(diǎn)在于探針分子和目標(biāo)化合物之間的相互作用是可逆的，可用于檢測生物靶分子的動態(tài)變化。然而，這種熒光探針通常不敏感且不特異。例如，溶液檢測系統(tǒng)的極性變化將導(dǎo)致弱相互作用的巨大變化，特別是在水溶液中，如氫鍵，配位鍵等其他效應(yīng)將變得非常弱，導(dǎo)致這種類型的熒光探針靈敏度比較低。第二類，利用探針分子與底物目標(biāo)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，即反應(yīng)型探針，生成新的化合物，從而改變探針的分子結(jié)構(gòu)與原始光學(xué)性能，以達(dá)到識別目標(biāo)分子的目的（圖1.3b）。這種強(qiáng)相互作用可以改變探針分子取代基的電子供體和吸引能力，探針結(jié)構(gòu)的共軛度和探針螺旋環(huán)的開關(guān)環(huán)等，從而改變探針系統(tǒng)的熒光性能并實(shí)現(xiàn)確定目標(biāo)分析物的目的。這種探針的優(yōu)點(diǎn)是探針與靶分子發(fā)生不可逆的化學(xué)變化，從而可以充分積累反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度，提高熒光探針的靈敏度。然而，這種類型的探針不能用于監(jiān)測生物靶分子的動態(tài)變化。反應(yīng)熒光探針一直受到全世界科學(xué)家的青睞，特定的化學(xué)反應(yīng)已廣泛用于改善熒光探針檢測靶分子的性能。第三類，當(dāng)探針的接受體識別到底物目標(biāo)分子，底物置換出探針的熒光團(tuán)，熒光團(tuán)可以恢復(fù)自身的光學(xué)性質(zhì)，發(fā)出熒光，從而達(dá)到識別特定目標(biāo)分子的作用（圖1.3c）。圖1.3小分子熒光探針的三種探針類型1.4.2小分子熒光探針的響應(yīng)機(jī)理小分子熒光探針的響應(yīng)機(jī)理主要有：光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）、通鍵能量轉(zhuǎn)移（TBET）。1.4.2.1基于ICT的比率熒光探針基于內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移（ICT）的探針的特征在于與一個(gè)分子內(nèi)的電子接受單元綴合的電子給體單元，其在激發(fā)態(tài)下產(chǎn)生“推-拉”π-電子系統(tǒng)。它們已被廣泛用于陽離子傳感。在給電子部分與陽離子相互作用時(shí)，探針的給電子特性降低。這導(dǎo)致吸收光譜的藍(lán)移。相反，當(dāng)陽離子與電子接受部分相互作用時(shí)，由于ICT變得更加發(fā)達(dá)，在吸收光譜中觀察到明顯的紅移。此外，還可以觀察到熒光量子產(chǎn)率和壽命的變化。早期由Valeur引入了陽離子傳感的ICT戰(zhàn)略，從那時(shí)起，基于比率檢測的各種基于ICT的熒光分子已被用于目標(biāo)分析物的成像。例如，Tsien等人設(shè)計(jì)的基于ICT的探針可以對H+，Na+和Mg2+以及Ca2+離子進(jìn)行生理監(jiān)測。Nagano課題組等人設(shè)計(jì)的比率Zn2+探針，稱為ZnAF-R1，ZnAF-R2，ZnIC和DIPCY。細(xì)胞膜可滲透探針ZnAF-R2和ZnIC也用于監(jiān)測活細(xì)胞中的Zn2+濃度。塔基課題組等人開發(fā)了一種比率Cd2+傳感器CadMQ，相對于其他重金屬離子和過渡金屬離子，包括水介質(zhì)中的Zn2+，它具有優(yōu)異的Cd2+選擇性。該探針可以有效地用于活細(xì)胞中Cd2+的比率傳感。在開創(chuàng)性工作中，Shinkai和James團(tuán)隊(duì)已經(jīng)制備了糖類傳感ICT探針，這些探針在現(xiàn)實(shí)世界的應(yīng)用中仍具有前景。另外，通過結(jié)合香豆素和部花青酸構(gòu)建的混合熒光團(tuán)被開發(fā)用于比例感測H2S。該探針由于其ICT特性而顯示出強(qiáng)吸收帶。它顯示分別由香豆素和部花青亞基產(chǎn)生的兩個(gè)良好分辨的發(fā)射帶。在H2S存在下，部花青的排放強(qiáng)度降低，而香豆素的強(qiáng)度增加。當(dāng)溶解在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7.4）中時(shí)，發(fā)現(xiàn)溶液顏色在暴露于H2S時(shí)從深藍(lán)色變?yōu)榉浅\的藍(lán)色。通過兩個(gè)發(fā)射帶的強(qiáng)度比確定H2S的檢測極限，并且發(fā)現(xiàn)其為約1mM。此外，該特定探針優(yōu)先定位于線粒體中并允許細(xì)胞內(nèi)H2S的實(shí)時(shí)成像。1.4.2.2基于ESIPT的比率熒光探針激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）通常涉及在熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)下從羥基（或氨基）單元到羰基氧（或亞胺氮）原子的快速質(zhì)子轉(zhuǎn)移。例如，2-（20-羥基苯基）苯并惡唑（HBO）優(yōu)選以烯醇形式（E）存在，并且通過基態(tài)的分子內(nèi)六元環(huán)H-鍵合基序穩(wěn)定。在320nm激發(fā)后，由于ESIPT，激發(fā)的烯醇形式（E*）轉(zhuǎn)化為激發(fā)的酮互變異構(gòu)體（K*）。該過程產(chǎn)生具有大斯托克斯位移的發(fā)射帶（~500nm）。在衰變至基態(tài)后，酮形式（K）通過反向質(zhì)子轉(zhuǎn)移返回到烯醇形式。不經(jīng)歷ESIPT的其他激發(fā)的烯醇分子通常在較高能量（例如，~430nm）下顯示發(fā)射帶。在許多條件下，ESIPT熒光團(tuán)顯示兩個(gè)來自烯醇和酮形式的發(fā)射帶。這些波段相對強(qiáng)度的變化可為比率傳感系統(tǒng)提供基礎(chǔ)。通過分子間氫鍵相互作用或溶劑極性變化對分子內(nèi)排列的擾動已得到廣泛研究。此外，環(huán)境光學(xué)特征中的相關(guān)調(diào)制為ESIPT染料的若干應(yīng)用提供了背景，包括分析化學(xué)中的極性敏感探針，分子邏輯門，發(fā)光材料，聚合物科學(xué)中的讀出元件，膠體化學(xué)中的標(biāo)記和生化標(biāo)記。其他幾種ESIPT染料，包括2-（20-羥基苯基）-苯并惡唑（HBO），2-（20-羥基苯基）苯并噻唑（HBT），N-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-（羥基苯基）苯甲酰胺）（3-BTHPB）和3-羥基黃酮（3HF）已被開發(fā)為比率熒光探針。例如，Demchenko和Mely設(shè)計(jì)了基于3HF的ESIPT探針，其用作熒光生物膜探針，其允許比率檢測細(xì)胞凋亡。Peng課題組等人設(shè)計(jì)并合成了基于HBO的ESIPT探針，用于檢測氟離子和乙酸根離子。金屬離子結(jié)合也可引發(fā)ESIPT效應(yīng)。例如，Pang等人設(shè)計(jì)出了基于HBO的熒光探針，在Zn2+離子絡(luò)合作用下產(chǎn)生ESIPT發(fā)射。在其他研究中，Kim課題組等人報(bào)道了一種基于HBT的探針，它通過磷酸化HBT羥基來抑制ESIPT，從而產(chǎn)生烯醇衍生的發(fā)射特征。然而，選擇性酶促（MKP-6;蛋白酪氨酸磷酸酶）水解后，發(fā)生ESIPT以產(chǎn)生基于酮基于互變異構(gòu)體的發(fā)射。類似地，發(fā)現(xiàn)其中羥基被叔丁基二苯基氯硅烷保護(hù)的探針（BTTPB）對于膠束混合物中的氟陰離子檢測是有效的。觀察到ppb水平的靈敏度，并且易于制備的測試紙的擴(kuò)展證明易于生效。遺憾的是，基于ESIPT的比率檢測在某些情況下證明是有限的，因?yàn)樘结樤谒橘|(zhì)中的簡單質(zhì)子化會產(chǎn)生意外的和非分析物依賴性熒光變化。1.4.2.3基于FRET/TBET的比率熒光探針熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和自發(fā)能量轉(zhuǎn)移（TBET）機(jī)制分別涉及作為能量供體和受體的一對熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移。應(yīng)用于傳感應(yīng)用中，發(fā)射相對較短波長的供體用于激活較長波長的受體發(fā)射，這兩種發(fā)射的比例由目標(biāo)分析物調(diào)節(jié)。供體發(fā)射和受體吸收帶之間的基本光譜重疊通常需要顯示出高FRET效率。由于這種光物理要求，基于FRET的二元體通常通過非共軛間隔物與通過空間發(fā)生的能量轉(zhuǎn)移相連。由于Stryer和Haugland利用FRET作為“光譜尺”，F(xiàn)RET已成為分析DNA結(jié)構(gòu)，核酸調(diào)控，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，功能分析和免疫測定的重要工具。在基于TBET的二元體的情況下，供體和受體通過電子共軛鍵連接。這可以防止供體和受體片段變成平面。因此，能量轉(zhuǎn)移可以通過連接鍵或鍵而不需要光譜重疊。在這些開創(chuàng)性的努力之后，許多基于FRET/TBET的熒光探針已被提出用于金屬陽離子的比率檢測。金屬離子，例如Hg2+，Pb2+，Ag+和Cu2+，通常通過電子轉(zhuǎn)移或重金屬離子效應(yīng)作為激發(fā)態(tài)猝滅劑。結(jié)果，探針的熒光被淬滅。在早期的工作中，Akkaya課題組等人設(shè)計(jì)了幾個(gè)具有π-擴(kuò)展BODIPY衍生物的基于FRET的“盒”，并證明了它們在Hg2+離子傳感中的應(yīng)用。在Hg2+離子存在下，能量轉(zhuǎn)移效率得到提高。這種增加產(chǎn)生熒光發(fā)射特征的相關(guān)比例變化。Burgess課題組等人報(bào)告了TBET盒的設(shè)計(jì)概念，可用于許多分子生物學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用。在一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究中，涉及一系列帶有BOPIPY基供體和花青受體的TBET分子，Burgess小組證明，在激發(fā)BODIPY部分時(shí)，激發(fā)能通過乙炔橋轉(zhuǎn)移到花青染料受體上，發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長取決于花青受體的結(jié)構(gòu)，并且可以在約600至800nm的范圍內(nèi)變化。因此，這為成像提供了大的光譜窗口，并且被認(rèn)為是有用的特征。這組探針可以封裝在磷酸鈣-硅酸鹽納米粒子中，可以自由分散在水中，并應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)成像磷酸鈣-硅酸鹽納米粒子，可以在水中自由分散并應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)成像。在典型的FRET系統(tǒng)中，羅丹明的開環(huán)用于通過誘導(dǎo)來控制開啟信號。供體染料的發(fā)射和羅丹明受體的吸收之間的光譜重疊。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了許多基于羅丹明的FRET傳感器。這些包括用于Cu2+感應(yīng)的羅丹明-丹酰基二元體，用于一氧化氮和HOCl檢測的羅丹明香豆素二元體，用于Hg2+感測的羅丹明-BODIPY二元體或用于分析含巰基的分析物，例如半胱氨酸等。這些系統(tǒng)中的一些已經(jīng)被用于影響活細(xì)胞中某些分析物的比率成像。當(dāng)用于TBET系統(tǒng)時(shí)，羅丹明開環(huán)過程激活了通過鍵能量轉(zhuǎn)移事件。Tan課題組等人已經(jīng)開發(fā)了這種方法，他開發(fā)了一種基于羅丹明的雙光子TBET探針，可以對活細(xì)胞和組織進(jìn)行雙光子成像。該系統(tǒng)允許高分辨率比率成像，具有良好的組織穿透性（最大180mm）。1.4.2.4基于單體-準(zhǔn)分子的比率傳感探針準(zhǔn)分子是由激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)與基態(tài)相同結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)的p-軌道相互作用形成的復(fù)合物，激發(fā)子的形成是由激發(fā)驅(qū)動的，也是由組分的局部濃度驅(qū)動的。準(zhǔn)分子的發(fā)射特征不同于單體發(fā)射（未復(fù)合的熒光團(tuán)）的發(fā)射特征，并且通常以紅移波長和缺乏振動結(jié)構(gòu)（導(dǎo)致寬發(fā)射帶）為特征?；谶@些差異，分析物驅(qū)動的準(zhǔn)分子的分離和相對取向的變化可導(dǎo)致單體和準(zhǔn)分子排放的比例差異。研究良好的熒光團(tuán)芘被認(rèn)為是基于準(zhǔn)分子的分析物檢測中最有用的傳感分子之一。其特征在于370-380nm的單體發(fā)射和460-480nm的準(zhǔn)分子發(fā)射。迄今為止，許多研究小組報(bào)告了基于芘的金屬離子探針，磷酸鹽或含磷酸鹽的生物分子，如細(xì)菌alarmone（p）ppGpp和腺苷-5-三磷酸（ATP）。1.4.3小分子熒光探針的研究進(jìn)展近年來，熒光探針由于其簡單，方便和可廣泛用于化學(xué)，生物和環(huán)境中而受到相當(dāng)多的關(guān)注。到目前為止，熒光探針在生物體方面已經(jīng)檢測了許多重要的離子。1.4.3.1用于檢測羥基自由基的新型比率熒光探針?OH是最有害的細(xì)胞內(nèi)ROS之一，可對生物大分子（包括核酸，蛋白質(zhì)，脂類和碳水化合物）造成嚴(yán)重?fù)p害。為了充分了解?OH的生物學(xué)作用，人們強(qiáng)烈希望利用高度選擇性和敏感性的方法來監(jiān)測其生命系統(tǒng)的生成，分布和動態(tài)波動。然而，由于高反應(yīng)性，短壽命（體內(nèi)：t1/2=10-9秒）和細(xì)胞濃度低，內(nèi)源性?OH的監(jiān)測極具挑戰(zhàn)性。在過去的幾十年中，已經(jīng)開發(fā)了幾種用于檢測?OH的技術(shù)，例如電子自旋共振（ESR）光譜，色譜，分光光度法和電化學(xué)傳感。。然而，這些方法僅適用于體外?OH測量。近年來，已有幾種報(bào)道的熒光探針用于生物系統(tǒng)中的?OH檢測，使用小分子或納米材料熒光團(tuán)。盡管如此，大多數(shù)報(bào)道的探針都是基于強(qiáng)度的探針，它們感知?OH只有熒光強(qiáng)度的光信號變化，很容易受到許多因素的影響，如儀器效率，環(huán)境變化（pH，極性，溫度等等））和探針分布。相反，比率熒光探針更有利，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^內(nèi)置校正兩個(gè)發(fā)射帶來消除干擾信號輸出的大多數(shù)或所有因素。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了一些用于?OH的比率熒光探針，然而，其中一些具有一些缺點(diǎn)，例如差的靈敏度和成像選擇性?OH優(yōu)于其他ROS。在此基礎(chǔ)上，Wu課題組等人設(shè)計(jì)并合成了一種用于監(jiān)測羥基自由基（?OH）的新型比率熒光探針4（圖1.4）。探針4利用二氰基乙烯基作為新的反應(yīng)位點(diǎn)并顯示出NIR發(fā)射。用?OH處理后，探針4得到香豆素衍生物，并且在發(fā)射中顯示出160nm的極大藍(lán)移，在水性介質(zhì)中具有~826倍的OH響應(yīng)比信號增強(qiáng)。探針4對?OH具有高選擇性，幾乎不受其他ROS/RNS物種的干擾。此外，探針4已成功應(yīng)用于以比率熒光成像方式監(jiān)測LPS處理的SMMC-7721細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性?OH。因此，探針4是用于發(fā)現(xiàn)?OH相關(guān)生物過程的有用工具。圖1.4探針4的傳感機(jī)理圖1.4.3.2用于檢測ClO-的熒光探針作為一類活性氧（ROS），次氯酸鹽（ClO-）/次氯酸（HClO）在生理過程中起著至關(guān)重要的作用，可以在催化作用下由過氧化氫和氯離子產(chǎn)生。此外，它在生物系統(tǒng)中也很重要，但不適當(dāng)攝入ClO-最終會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性疾病，如帕金森?。≒D），阿爾茨海默?。ˋD），甚至癌癥。因此，對生物系統(tǒng)中ClO-的鑒定和研究具有重要意義。Wang課題組等人報(bào)道了用于選擇性檢測ClO-的水溶性紅色發(fā)光探針1（圖1.5）。探針1對ClO-顯示出良好的靈敏度，檢測下限為2.41nM。共聚焦顯微鏡的結(jié)果顯示探針1可以在活細(xì)胞中追蹤外源和酶促產(chǎn)生的ClO-。高選擇性和敏感的紅色熒光探針將是一個(gè)很有前途的工具，用于說明ClO-在生命系統(tǒng)中的功能。圖1.5探針1的傳感機(jī)制圖此外，Tang課題組等人基于氰基聯(lián)苯衍生物和二氨基馬來腈基團(tuán)設(shè)計(jì)了針對ClO-的比率熒光和比色探針1（圖1.6）。探針1對次氯酸鹽顯示出獨(dú)特的光學(xué)選擇性，并且其他常見陰離子或活性氧物質(zhì)的存在不會干擾檢測結(jié)果。在H2O分子的共同作用下，ClO-的加入誘導(dǎo)了探針分子中腙鍵的斷裂，伴隨著游離熒光團(tuán)的釋放，產(chǎn)生熒光從紅色到綠色的顯著變化。研究人員還進(jìn)行了生物實(shí)驗(yàn)和真實(shí)水試驗(yàn)，均表明探針1具有極好的實(shí)用性。這實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法為比率傳感裝置的構(gòu)造提供了一些有用的信息。圖1.6探針1與ClO-的反應(yīng)過程圖1.4.3.3用于檢測Hg2+的熒光探針眾所周知，重金屬和過渡金屬（HTM）離子的檢測在化學(xué)，生物學(xué)和環(huán)境的廣泛領(lǐng)域具有重要意義。水溶性二價(jià)汞離子（Hg2+）是HTM離子中最重要的，因?yàn)樗哂谐裘阎亩拘院推毡樾?。Hg2+離子即使在非常低的濃度下也會引起幾種嚴(yán)重的疾病，如腦損傷，胃腸系統(tǒng)疾病，腎病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因?yàn)樗鼈兒苋菀淄ㄟ^皮膚或食道進(jìn)入體內(nèi)。因此，開發(fā)用于檢測Hg2+離子的簡單方法受到了極大的關(guān)注。Yuan課題組等人報(bào)道了熒光探針BAA的簡單合成策略（圖1.7）。為了提高探針對Hg2+的結(jié)合能力和選擇性，在探針的偶氮基團(tuán)的相鄰位置引入炔基。頻譜分析表明BAA表現(xiàn)出高選擇性開啟熒光信號且能夠在寬pH范圍（3-10）內(nèi)檢測Hg2+，并表現(xiàn)出對Hg2+（約10秒）的快速響應(yīng)特征。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BAA僅在Hg2+存在下顯示綠色熒光發(fā)射。探針BAA優(yōu)異的膜參透性也使它成功用于通過共聚焦熒光成像檢測MCF-7活細(xì)胞中的Hg2+。這里探索的輕便“開啟”Hg2+熒光探針可能在環(huán)境測試，生物醫(yī)學(xué)和食品分析方面具有進(jìn)一步的潛在應(yīng)用。圖1.7探針BAA的合成路線1.5過氧亞硝基陰離子的簡介過氧亞硝基陰離子（ONOO-）是生命系統(tǒng)中內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧（ROS）之一，可以在各種生理和病理?xiàng)l件下在線粒體中產(chǎn)生，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，并且還表現(xiàn)出抗微生物和抗菌活性。過氧亞硝基陰離子（ONOO-）代謝產(chǎn)物為羥基自由基和二氧化氮自由基。在生物系統(tǒng)中，ONOO-的半衰期為10-20ms。通過離子通道，它可以隨意通過生物膜。在細(xì)胞中產(chǎn)生的ONOO-可以通過氨基酸殘基中的硫醇氧化，絡(luò)氨酸的硝化，蛋氨酸的氧化，色氨酸的氧化和硝化來修飾蛋白質(zhì)并改變它們的活性，從而損傷核酸DNA、蛋白質(zhì)和脂類，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最近的證據(jù)表明，ONOO-與阿爾茨海默病，關(guān)節(jié)炎，癌癥，自身免疫和炎癥性疾病以及其他疾病有關(guān)。1.6過氧亞硝基陰離子熒光探針的研究進(jìn)展1.6.1基于氫醌的雙光子熒光探針Yang課題組等人開發(fā)了一種含有4-羥基苯胺部分作為ONOO-識別受體的新型熒光探針，但該探針容易受到包括羥基（?OH）和次氯酸（HOCl）在內(nèi)的活性氧（ROS）的干擾。Kim課題組等人已經(jīng)開發(fā)出具有硼酸頻哪醇酯識別單元的熒光探針用于ONOO-，但這種硼酸鹽識別部分已經(jīng)被證實(shí)可以檢測相關(guān)的ROS（即H2O2，OCl-）。此外，Wang課題組等人已開發(fā)出一種新型酮酰胺類熒光探針用于體內(nèi)監(jiān)測ONOO-，但酮酰胺的識別動力可用于設(shè)計(jì)用于檢測H2O2的熒光探針。因此，開發(fā)用于檢測ONOO-的特定熒光探針而沒有ROS的干擾仍然是具有挑戰(zhàn)性的。為此，Zhu課題組等人設(shè)計(jì)并合成了一種簡單的4-羥基萘酰亞胺衍生的雙光子熒光探針TPHQ（如圖1.8），用于檢測ONOO-。圖1.8TPHQ雙光子熒光探針為了檢驗(yàn)探針TPHQ是否能夠特異性地跟蹤復(fù)雜生物系統(tǒng)中的細(xì)胞內(nèi)ONOO-水平，Zhu等人加入較高濃度的H2O2（20倍ONOO-），但不能引起明顯得熒光增強(qiáng)；而加入較高濃度的OCl-（20倍ONOO-）僅導(dǎo)致非常少的熒光增強(qiáng)，這些結(jié)果證實(shí)探針TPHQ對ONOO-具有出色的選擇性，而不受H2O2和OCl-的干擾，這可能歸因于ONOO-對氫醌的強(qiáng)氧化性比H2O2和OCl-更強(qiáng)。另一方面，上述數(shù)據(jù)間接證明了氫醌部分是ONOO-的優(yōu)選識別受體，具有優(yōu)于H2O2和OCl-的特異性。通過文獻(xiàn)光譜結(jié)果可知，探針TPHQ和ONOO-的反應(yīng)導(dǎo)致氫醌部分的去除，結(jié)果釋放出4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺熒光團(tuán)。通過HRMS分析可證實(shí)4-羥基-1,8-萘二甲酰亞胺熒光團(tuán)的產(chǎn)生。TPHQ探針傳感機(jī)制如圖1.9。圖1.9TPHQ熒光探針傳感機(jī)制圖示含有氫醌部分的新識別受體的探針TPHQ相對于其他各種生物相關(guān)分析物（包括H2O2和OCl-）表現(xiàn)出對ONOO的特異性。另外，探針TPHQ能夠快速且靈敏地監(jiān)測ONOO-。最后，具有低細(xì)胞毒性和令人滿意的細(xì)胞膜滲透能力的探針TPHQ成功應(yīng)用于活細(xì)胞中ONOO-水平的監(jiān)測。這些結(jié)果使得探針TPHQ成為揭示ONOO-的多種病理生理學(xué)的有希望的候選者。1.6.2基于羅丹明衍生物和酰肼反應(yīng)基團(tuán)的熒光探針Yang課題組等人使用酰肼作為反應(yīng)基團(tuán)描述了羅丹明B基熒光探針I(yè)用于ONOO-。然而，沒有測試該探針被次氯酸鹽（ClO-）干擾。此外，Zhang課題組等人報(bào)道了熒光探針I(yè)I，其中包含雙反應(yīng)位點(diǎn)，可以同時(shí)檢測不同通道中的羥基自由基（?OH）和次氯酸（HClO）。但是，酰肼作為反應(yīng)用于檢測HClO，其功能不受ONOO-的干擾。因此，Wu課題組等人通過適當(dāng)選擇合成的熒光團(tuán)來調(diào)節(jié)酰肼基團(tuán)的反應(yīng)性，開發(fā)了一種新的羅丹明衍生物熒光探針1，用于檢測通過酰肼基團(tuán)反應(yīng)起作用的ONOO-。與其他ROS/RNS相比，該探針對ONOO-顯示出高靈敏度和選擇性。探針1和ONOO-的反應(yīng)產(chǎn)物顯示長波長吸收（600nm）和發(fā)射（638nm）帶。另外，該探針用于成像HeLa細(xì)胞中的外源ONOO-和RAW264.7細(xì)胞中的內(nèi)源性O(shè)NOO-以及小鼠感染模型的嗜中性粒細(xì)胞。1.6.3基于氫醌的特異性熒光探針Gal-NHP由于內(nèi)部環(huán)境的復(fù)雜性和高自發(fā)熒光，開發(fā)用于在生命系統(tǒng)中追蹤ONOO-的細(xì)胞特異性熒光探針仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。Liu課題組等人利用羥基萘二甲酰亞胺作為熒光團(tuán)和氫醌部分作為響應(yīng)受體，開發(fā)了一種附加半乳糖的肝癌特異性熒光探針Gal-NHP，用于靈敏地檢測活HepG2細(xì)胞中的內(nèi)源性O(shè)NOO-。探針Gal-NHP可選擇性地追蹤ONOO-而不受來自其他物種如HOCl和H2O2的干擾。此外，半乳糖的引入增強(qiáng)了該探針的水溶性，并且Gal-NHP可以在水溶液中快速響應(yīng)ONOO-。定量實(shí)驗(yàn)表明該探針具有良好的線性關(guān)系，具有良好的靈敏度。最重要的是，熒光成像結(jié)果顯示它具有優(yōu)異的肝癌特異性能力，可以實(shí)時(shí)成功檢測內(nèi)源性O(shè)NOO-肝癌細(xì)胞。因此，這種新開發(fā)的探針將有益于揭示ONOO-在肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中的作用。1.6.4基于羅丹明的熒光探針RPTPP對于活細(xì)胞，ONOO-主要在線粒體內(nèi)產(chǎn)生，因此，監(jiān)測線粒體ONOO-將為其形成和功能提供更直接的視角。然而，能夠敏感地和選擇性地檢測線粒體中的ONOO-的熒光探針仍然是罕見的，對于此現(xiàn)象，Li課題組等人設(shè)計(jì)并合成了線粒體可靶向熒光探針RPTPP（圖1.10）。該熒光探針使用羅丹明作為穩(wěn)定且高量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)，苯肼作為識別部分，三苯基鏻陽離子作為線粒體靶向部分。在探針與ONOO-反應(yīng)后，通過ONOO-氧化苯肼并隨后水解打開非熒光螺環(huán)結(jié)構(gòu)，從而觸發(fā)熒光開啟響應(yīng)，這種高靈敏度的熒光反應(yīng)可用于監(jiān)測線粒體ONOO-的變化。圖1.10熒光探針RPTPP響應(yīng)機(jī)制圖1.7本課題研究目的在生命系統(tǒng)中，ONOO-扮演著一個(gè)重要的角色，它的產(chǎn)生或多或少會給人體帶來危害，對ONOO-進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測可以有效研究ONOO-在生命系統(tǒng)中作用機(jī)理，有助于對ONOO-相關(guān)疾病的控制。而熒光探針由于靈敏度高、可實(shí)時(shí)檢測、對生物無破壞性等優(yōu)點(diǎn)，用于檢測ONOO-已成為目前研究熱點(diǎn)。隨著ONOO-探針的不斷被報(bào)道，設(shè)計(jì)高靈敏度且選擇性好的探針仍是研究重點(diǎn)。本課題在查閱各種文獻(xiàn)及資料的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成出一種以6-羥基-2-萘甲醛為反應(yīng)原料的ONOO-熒光探針，并通過各種儀器分析該探針對ONOO-的選擇性以及靈敏度高低，并為以后的研究工作提供實(shí)踐基礎(chǔ)。過氧亞硝基陰離子熒光探針的設(shè)計(jì)合成與分析2.1實(shí)驗(yàn)部分2.1.1主要儀器儀器名稱生產(chǎn)商熒光光譜儀德國斯派克核磁共振波譜儀德國布魯克pH計(jì)上海博取儀器有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮磁力攪拌器上海知性實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司手提式紫外分析儀上海嘉鵬科技有限公司分析天平日本島津低溫冷卻循環(huán)泵上海知性實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司紫外-可見光分光光度計(jì)日本島津2.1.2主要試劑試劑名稱純度生產(chǎn)商6-羥基-2-萘甲醛分析純浙江明鋒Tf2O（三氟甲磺酸酐）分析純南京邦諾生物科技有限公司吡啶分析純天誠化工有限公司聯(lián)硼酸頻那醇酯分析純上海藍(lán)潤化學(xué)有限公司1,4-二氧己環(huán)分析純江蘇森萱醫(yī)藥化工有限公司石油醚分析純天津市富宇精細(xì)化工有限公司二氯甲烷分析純天津市富宇精細(xì)化工有限公司乙酸乙酯分析純天津市富宇精細(xì)化工有限公司甲醇分析純天津市富宇精細(xì)化工有限公司氬氣太原鋼鐵集團(tuán)DPPF-PdCl2催化劑分析純湖北鑫鳴泰化學(xué)有限公司2.1.3目標(biāo)化合物的合成2.1.3.1探針L3的合成路線探針L1的合成路線是使用化合物L(fēng)1（6-羥基-2-萘甲醛）作為反應(yīng)原料，加入Tf2O（三氟甲磺酸酐），與Tf2O（三氟甲磺酸酐）反應(yīng)生成中間產(chǎn)物L(fēng)2，然后，在Ar環(huán)境下，再用中間產(chǎn)物L(fēng)2與L4反應(yīng)，生成最終探針產(chǎn)物L(fēng)3，產(chǎn)率為60%。2.1.3.2化合物L(fēng)2的合成稱量888mg化合物L(fēng)1（6-羥基-2-萘甲醛）于圓底燒瓶，依次加入25ml二氯甲烷（不溶）和0.5ml吡啶，在冰浴條件下加入0.96mlTf2O（三氟甲磺酸酐），然后，把溶液放在磁力攪拌器上過夜反應(yīng)（在常溫條件下）。次日在溶液中加入二氯甲烷溶解，分離出有機(jī)相和水相；用二氯甲烷萃取水相2次，并收集有機(jī)相。將全部有機(jī)相用飽和NaCl溶液洗滌3次，隨后用無水Na2SO4干燥，過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋干溶液，采用層柱析分離法（乙酸乙酯：石油醚=1:4）分離收集得到化合物L(fēng)2溶液，然后減壓旋干溶液得到固體中間產(chǎn)物L(fēng)2835mg。2.1.3.3化合物L(fēng)3的合成稱量固體中間產(chǎn)物L(fēng)2（426mg）、化合物L(fēng)4（540mg）、NaOAc（1.15g）和DPPF-PdCl2催化劑（102mg），將它們混合抽真空，并且通入Ar；在Ar的保護(hù)下通入無水1,4-二氧己環(huán)溶劑溶解混合物；加熱到105℃，回流反應(yīng)24小時(shí)。然后冷卻到室溫，用飽和NaCl溶液洗滌3次，分液后用無水Na2SO4干燥有機(jī)相，接著過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋干液體，采用層柱析分離法（乙酸乙酯：石油醚=1:4）分離收集得到化合物L(fēng)3溶液，然后減壓旋干溶液得到最終產(chǎn)物L(fēng)3，產(chǎn)率為60%。1HNMR（300MHz,CDCl3）：δ10.17（s，1H），8.41（d，j=24Hz，1H），7.95（s，4H），1.40（d，j=51Hz,12H）。圖2.1最終產(chǎn)物L(fēng)3的1HNMR2.1.4光譜測試溶液的制備PBS（磷酸鹽緩沖液）溶液（0.01mol/L，pH=7.4）的制備：①先配制0.2mol/LNa2HPO4，稱量71.64gNa2HPO4?12H2O加蒸餾水至1000ml；②再配制0.2mol/LNaH2PO4,稱量35.6gNaH2PO4?2H2O加蒸餾水至1000ml；③按取81.0ml①溶液+19.0ml②溶液的比例，再加入17.0gNaCl和1800ml蒸餾水，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.4后再加入蒸餾水補(bǔ)足至2000ml。熒光探針L3的配制：用色譜純DMSO溶解熒光探針L3并且定容得到1mmol/L的探針母液，然后取3μl探針母液加入到3ml比色皿中，用3mlPBS（磷酸鹽緩沖液）溶液（0.01mol/L，pH=7.4）稀釋到1μmol/L作為熒光探針L3溶液。過氧亞硝基陰離子（ONOO-）溶液的配制：根據(jù)文獻(xiàn)方法合成，用0.1mol/L氫氧化鈉水溶液稀釋，通過紫外吸收光譜測定302nm的吸光度值，依據(jù)朗伯-比爾定律計(jì)算過氧亞硝酸根的濃度，ε=1670M-1cm-1。2.2結(jié)果與討論2.2.1探針L3對0NOO-的熒光響應(yīng)研究為了研究探針L3對0NOO-的熒光響應(yīng)，我們用紫外-可見光分光光度計(jì)對探針L3進(jìn)行了紫外-可見光吸收光譜的測定。圖2.2探針L3與ONOO-反應(yīng)前后的紫外-可見吸收光譜圖如圖2.2所示，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，探針L3（10μM）本身在紫外-可見光吸收光譜中300nm左