核酸檢測實驗室建立與應用

核酸檢測實驗室建立與應用衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測聯(lián)合實驗室葉賢林12/11/20231.核酸擴增檢測實驗室的建立人員場地檢測方法選擇實施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號）12/11/20232.核酸實驗室人員要求資質:經(jīng)過臨檢中心PCR培訓班培訓并取得上崗證；通過血站核酸實驗室崗前培訓考試合格。培訓:①無”核酸”的概念形成,②防污染的概念③良好工作習慣的培養(yǎng).④報告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).12/11/20233.試劑準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)樣本離心交接區(qū)報告發(fā)放區(qū)核酸實驗場地12/11/20234.

方法選擇:TMA與PCRTMAPCR擴增原理模擬自然DNA轉錄成mRNA的過程模擬自然DNA復制的過程靶目標RNADNA酶MMLV逆轉錄酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反應體系兩種酶，兩條引物，dNTP,NTP一種酶，一對引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5℃）循環(huán)導熱（變性，退火，延伸）擴增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴增產(chǎn)物RNADNA擴增速度每個循環(huán)可以生成100-1000個復制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復制物以2n擴增，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大10億倍12/11/20235.TMA的優(yōu)點缺點自動化程度高靈敏度高擴增效率高：10n

不能絕對定量12/11/20236.PCR的優(yōu)點缺點易于自動化靈敏度高擴增效率高匯集拆分過程繁瑣拆分可減低非反應性比率12/11/20237.核酸試劑質控試劑的確認試劑運輸過程的控制(溫度\條件\時限)靈敏度的要求內(nèi)標的要求試劑涵蓋的基因型

12/11/20238.檢測流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標本檢測流程12/11/20239.檢測流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標本檢測流程12/11/202310.檢測流程(3):平行檢測流程樣本清點交接核酸單份檢測常規(guī)檢測合格標本不合格標本陰性標本反應性標本合格標本發(fā)布結果單項目反應性無反應性陽性或可疑結果淘汰陽性或可疑結果淘汰12/11/202311.標準操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸實驗室設置與管理規(guī)范核酸實驗室標本檢測流程核酸實驗室崗位職責核酸實驗室關鍵試劑管理規(guī)范核酸實驗室儀器設備管理規(guī)范核酸實驗室檢測標本管理規(guī)范核酸實驗室室間質量評價規(guī)范核酸實驗室記錄管理制度核酸實驗室生物防護規(guī)范核酸反應性獻血者追蹤規(guī)程核酸實驗室檢測應急措施12/11/202312.標準操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸標本離心交接操作規(guī)程核酸標本提取及匯集操作規(guī)程(科華)核酸標本擴增檢測操作規(guī)程（科華）核酸標本全自動檢測分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標本檢測報告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標本檢測復檢操作規(guī)程生物安全柜標準操作規(guī)程可移動紫外線燈標準操作規(guī)程低溫高速離心機標準操作規(guī)程ABI7300型核酸擴增熒光檢測儀標準操作規(guī)程12/11/202313.

核酸實驗室防污染措施主要的污染源擴增產(chǎn)物標本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服12/11/202314.核酸實驗室防污染措施要有獨立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實驗室保持合理的通風對各區(qū)內(nèi)的設備、物料進行標示，專區(qū)專用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽性對照儲存在標本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭12/11/202315.核酸實驗室防污染措施使用外排式的生物安全柜自配試劑應分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應廢棄使用次氯酸鈉溶液消毒（臺面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線照射（空氣和臺面）使用無水乙醇溶液（空氣噴霧）12/11/202316.核酸實驗室污染后措施實驗室污染后，如何處理？通風次氯酸鈉溶液（擴增區(qū)不宜使用）HCL溶液（吸頭）紫外線（固定、移動）酒精噴灑（空氣）應設計有備用實驗室:如開設獨立的報告發(fā)放區(qū)作為備用12/11/202317.中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉錄及擴增過程的效率。血篩核酸檢測的內(nèi)標的作用內(nèi)標的作用質控整個反應。提示假陰性檢測結果。監(jiān)控反應的外部條件內(nèi)標濃度要合適保持適度的內(nèi)標失控.(<0.2%)12/11/202318.核酸試劑靈敏度評估概率單位回歸分析(PROBIT）用于描述劑量-反應或不同因素間的劑量-反應比較，反應結果應該是以二分類形式表達的。概率單位的回歸方程為：

PROBITPi=A+BXi12/11/202319.用國際標準品稀釋成不同濃度評估血液HBV核酸篩查方法，結果如下。請計算95%的檢出限量及可信范圍CI

序號濃度（IU/ml）陽性數(shù)/重復數(shù)

概率15003/310021006/61003508/81004307/887.55104/850652/825710/5012/11/202320.

AnalysisofParameterEstimates

Standard95%ConfidenceChi-

ParameterDFEstimateErrorLimitsSquarePr>ChiSq

Intercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028

log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011

應用SAS9.0軟件PROBIT分析結果12/11/202321.

ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.4982212/11/202322.12/11/202323.陽性獻血者的追蹤溝通原則:專業(yè)授權、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話、面談溝通技巧：表揚和鼓勵、合理解釋、知情、適當?shù)膯柡?2/11/202324.獻血者核酸檢測不合格解釋由于核酸檢測方法目前尚不能排除假陽性，對實驗過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻血者健康體檢指標。更不宜作為疾病診療指標。獻血者獻血權利仍保留。12/11/202325.關于核酸檢測的解釋匯集結果成反應性,拆分結果為陰性.內(nèi)標失敗.ELISA(+),核酸結果為(-)ELISA(-),核酸結果為(+)核酸單檢結果反應性與血液發(fā)放.化學發(fā)光法與核酸檢測.12/11/202326.1.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻血者漏檢。HBVDNA靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測亞型和突變株感染。3.假陽性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動化.5.需要規(guī)范化場地和高素質的操作人員.6.參加國際間室間質控,提高檢測水準.血液核酸篩查注意的問題12/11/202327.深圳血液中心核酸檢測概況對161228人份酶免疫檢測結果陰性標本進行核酸檢測，共檢出33例不相同HBVDNA陽性獻血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、HCVRNA陽性1例，定量結果為1.2×105IU/ml。3個月后追蹤結果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。12/11/202328.項目科華（自動化）科華（半自動化）美國羅氏上海浩源凱榮（CHIRON）方法學全自動提取+實時熒光PCR病毒離心富集+半自動提取+實時熒光PCR全自動提取+PCR-ELISA半自動提取+PCR+毛細管電泳分離TMA匯集量8×45ul8×150ul24×45ul5×200ul500ul單人份檢測數(shù)6849637041315121412514603HBVDNA陽性數(shù)122838HBV陽性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸檢測概況12/11/202329.HBVDNA陽性獻血者追蹤情況

對17位HBVDNA陽性獻血者進行了追蹤，9位獻血者發(fā)生血清轉換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻血者原為乙肝大三陽患者，經(jīng)治療后HBsAg轉陰后，獻血，常規(guī)檢測為合格，核酸檢測HBVDNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛栃?2/11/202330.12/11/202331.12/11/202332.12/11/202333.12/11/202334.12/11/202335.

HBVDNA檢測陽性獻血者追蹤概況追蹤時間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18－－－＋－＋+2124－－－＋－＋150452