基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)

Genechiptechnology第一節(jié)基因芯片簡介基因芯片的概念基因芯片的工作原理基因芯片分類特點基因芯片的基本構(gòu)造

2基因芯片技術(shù)1.基因芯片的概念芯片有基因芯片和蛋白質(zhì)芯片兩類?；蛐酒℅enechip）又稱DNA芯片、DNA陣列(DNAmicroarray)、cDNA芯片(DNAchip)、寡核苷酸陣列等。是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的；它將大量探針分子（cDNA、寡核苷酸或來自基因組的基因片段）固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進(jìn)行分析，從而迅速得出所要的信息。

3基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片主要是檢測各種生物毒素的，制備芯片的原料就是常見的所有可能的致病菌(甚至包括其不同種、菌株)所分泌的特定毒素的單抗。4基因芯片技術(shù)基因芯片包括二種模式：*一是將靶DNA固定于支持物上，適合于大量不同靶DNA的分析。如對食品致病菌的快速檢測鑒定。

二是將大量探針分子固定于支持物上，適合于對同一靶DNA進(jìn)行不同探針序列的分析。5基因芯片技術(shù)基因芯片結(jié)構(gòu)圖Affimetrix公司制作的DNA芯片6基因芯片技術(shù)2．基因芯片的工作原理基因芯片（GeneChip）工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析。

7基因芯片技術(shù)

8基因芯片技術(shù)9基因芯片技術(shù)3.基因芯片分類基因芯片總體上可分為三種主要類型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。這種方法的優(yōu)點是所需檢測設(shè)備與目前分子生物學(xué)所用的放射顯影技術(shù)相一致,相對比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測存在較多問題。

10基因芯片技術(shù)2）用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。這種方法點陣密度可有較大的提高，各個探針在表面上的結(jié)合量也比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。

11基因芯片技術(shù)3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。該方法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?2基因芯片技術(shù)

3.1基因芯片按用途可以分為:

表達(dá)譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片、毒理芯片13基因芯片技術(shù)3.2基因芯片按其材質(zhì)和功能可分為元件型微陣列芯片通道型微陣列芯片生物傳感芯片

毛細(xì)管電泳芯片PCR擴增芯片集成DNA分析芯片毛細(xì)管電層析芯片光學(xué)纖維陣列芯片白光干涉譜傳感器芯片生物電子芯片凝膠元件微陣列芯片藥物控制芯片14基因芯片技術(shù)3.3按基因芯片點陣的制備方法可分為3.3.1原位合成適用于寡核苷酸。根據(jù)預(yù)先設(shè)計的點陣序列在每個位點通過有機合成的方式直接聚合得到所要求的探針分子。有兩種途徑：①光刻法：可合成30nt左右，每步縮合率較低為95％左右，產(chǎn)率僅20％，需要特殊的合成試劑。②壓電打印法：可合成50nt左右，每步縮合率為99％以上，產(chǎn)率可達(dá)74％，不需要特殊的合成試劑。核苷酸nucleotide

15基因芯片技術(shù)3.3.2直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。將合成好的探針、cDNA、基因組通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。

優(yōu)點：方法較原位合成簡單，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長。

缺點：噴印的斑點大，探針密度低。16基因芯片技術(shù)3.4按基因芯片的支持物，可分為：薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。玻片型：這種芯片的點陣是通過原位合成技術(shù)制作的，點陣密度很高，所以必須借助于特殊的儀器對測定結(jié)果進(jìn)行解讀和分析。微板型：一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板。

17基因芯片技術(shù)集成電路型：將雜交技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合于一體有目的地通過電子裝置檢測或控制DNA等生物大分子的作用過程。18基因芯片技術(shù)4、基因芯片技術(shù)的特點其中關(guān)鍵就是基因芯片具有微型化、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化的特點，從而有可能實現(xiàn)“將整個實驗室縮微到一片芯片上”的愿望。“高通量性”盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、分析范圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面。19基因芯片技術(shù)第二節(jié)基因芯片的制作基因芯片(DNA芯片)技術(shù)主要包括四個主要步驟：芯片制作、樣品制備與標(biāo)記、分子雜交、信號檢測與結(jié)果分析20基因芯片技術(shù)DNA芯片的制作原理

21基因芯片技術(shù)1．芯片的制作要成功的制作芯片，需要準(zhǔn)備3大材料：準(zhǔn)備固定在芯片上的生物分子樣品、芯片片基和制作芯片的儀器。分兩步:1.1.支持物的預(yù)處理1.2.制備方法22基因芯片技術(shù)1.1支持物的預(yù)處理1.1.1對載體材料要求：①載體表面必須具有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性基團，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)。②使單位載體上結(jié)合的生物分子達(dá)到最佳容量。③載體應(yīng)當(dāng)是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性，包括機械的、物理的和化學(xué)的穩(wěn)定性。23基因芯片技術(shù)1.1.2支持物的預(yù)處理實性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需進(jìn)行預(yù)處理,使其表面衍生出羥基、氨基活性基團。膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜,通常包被氨基硅烷或多聚賴氨酸。24基因芯片技術(shù)25基因芯片技術(shù)1.2制備方法芯片種類較多，制備方法也不盡相同，但常用的基本上可分為兩大類：一類是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針），適用于寡核苷酸；一類是預(yù)合成后直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。26基因芯片技術(shù)原位合成有兩種途徑：一是光刻法（Affymerix公司專利技術(shù)），可以合成30nt左右，打印法可以合成40-50nt，每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產(chǎn)率僅20%；一是壓電打印法，每步縮合率可達(dá)99%以上,合成30nt產(chǎn)率可達(dá)74%，從這個意義上說噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。27基因芯片技術(shù)1.2.1原位光刻合成寡聚核苷酸采用的原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個化學(xué)步驟能合成出4n個可能結(jié)構(gòu)。28基因芯片技術(shù)光導(dǎo)原位合成法制作基因芯片的步驟29基因芯片技術(shù)光導(dǎo)原位合成法制作基因芯片(圖)

30基因芯片技術(shù)1.2.2原位壓電打印法

(Piezoelectricprinting)

芯片壓電打印法合成原理與普通的彩色噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等合成試劑。噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學(xué)試劑。31基因芯片技術(shù)1.2.3點樣法

點樣法與原位合成法比較較簡單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。32基因芯片技術(shù)點樣法是將合成好的探針、或PCR技術(shù)擴增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后通過陣列復(fù)制器（arrayingandreplicatingdeviceARD）或陣列點樣機（arrayer）及電腦控制的機器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。33基因芯片技術(shù)點樣的方式分兩種：接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細(xì)管直接噴至固相支持物表面。宣堅剛.基因芯片.ppt34基因芯片技術(shù)35基因芯片技術(shù)36基因芯片技術(shù)37基因芯片技術(shù)2.樣品制備與標(biāo)記樣品制備待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標(biāo)記方法各異。制備方法：體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等。38基因芯片技術(shù)樣品標(biāo)記待測樣品的標(biāo)記，主要采用熒光分子。常規(guī)標(biāo)記通過在擴增過程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP，熒光標(biāo)記的單核苷酸分子，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進(jìn)行分子雜交。也可采用末端標(biāo)記法，直接在引物上標(biāo)記熒光。即在引物合成時通過應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNTP制備熒光標(biāo)記引物，或通過標(biāo)記生物素，進(jìn)行熒光標(biāo)記。39基因芯片技術(shù)對于陣列密度較小的基因芯片可以用同位素檢測法，采用32P標(biāo)記技術(shù)。高密度芯片的分析一般采用熒光素標(biāo)記探針，通過適當(dāng)內(nèi)參的設(shè)置及對熒光信號強度的標(biāo)化可對細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。40基因芯片技術(shù)新標(biāo)記方法——多色熒光標(biāo)記技術(shù)，可更直觀地比較不同來源樣品的基因表達(dá)差異，即把不同來源的探針用不同激發(fā)波長的熒光素標(biāo)記，并使它們同時與基因芯片雜交，通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖獲得不同樣品間差異表達(dá)基因的圖譜，常用的雙色熒光試劑有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光技術(shù)可大大提高芯片的準(zhǔn)確性和檢測范圍。41基因芯片技術(shù)42基因芯片技術(shù)3．雜交反應(yīng)雜交反應(yīng)是指標(biāo)記的樣品與芯片上的靶基因進(jìn)行雜交，產(chǎn)生檢測信號的過程。基因芯片與探針的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，但雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成，可同時平行檢測許多基因序列。43基因芯片技術(shù)雜交反應(yīng)條件的選擇合適的雜交條件可使生物分子間的反應(yīng)處于最佳狀態(tài)，增強其檢測的靈敏度，減少錯配率，提高信噪比。雜交反應(yīng)的條件要根據(jù)靶基因或探針的長度、標(biāo)記元素種類及芯片的類型來優(yōu)化。44基因芯片技術(shù)45基因芯片技術(shù)46基因芯片技術(shù)47基因芯片技術(shù)4.信號檢測與結(jié)果分析檢測原理芯片經(jīng)雜交反應(yīng)后，各反應(yīng)點形成強弱不同的光信號圖像，待測樣品與芯片上探針陣列雜交后，熒光標(biāo)記的樣品結(jié)合在芯片的特定位置上，形成強弱不同的光信號圖像，未雜交分子被除去，用激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點的熒光信號如熒光位置、熒光強度;再用相關(guān)軟件進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)處理，并與探針陣列的位點進(jìn)行比較，即可得出待測樣品的信息。48基因芯片技術(shù)檢測方法用同位素標(biāo)記靶基因，信號檢測即是放射自顯影；用熒光標(biāo)記，信號檢測即是熒光掃描及分析系統(tǒng)。圖像的分析可用落射熒光顯微鏡(EpifluorescenceMicro-scope)、電荷偶聯(lián)裝置照相機(Charge-coupledDeviceCamera)、共聚焦激光掃描儀(ConfocallaserScanner)等進(jìn)行。49基因芯片技術(shù)信號檢測與結(jié)果分析示意圖

50基因芯片技術(shù)51基因芯片技術(shù)基因芯片的特點DNA芯片的突出優(yōu)點在于：①強大的類比性。使得以往需多次處理的遺傳分析在同一時間和條件下快速完成。②巨大的信息產(chǎn)出率。在一張芯片上不僅可以獲得組織、細(xì)胞、血液等基因表達(dá)信號的定性、定量分析，還可實現(xiàn)全局檢測靜態(tài)到動態(tài)、時間與空間上的差異及遺傳信息。③高度敏感性和專一性。能可靠并準(zhǔn)確檢測出10pg/μl的DNA樣品。52基因芯片技術(shù)④高度重復(fù)性。一張由尼龍膜制作的微陣列，可以重復(fù)雜交使用多達(dá)20次。⑤微型化和自動化。現(xiàn)已出現(xiàn)的芯片面積最大不過525cm２，最小僅有1cm２；每個陣列中陣點樣品DNA的用量僅為5nl左右；試劑用量和反應(yīng)體積大大減少，反應(yīng)效率卻成百倍提高。⑥哺育新的實驗方法。此技術(shù)易與其它常規(guī)生物技術(shù)相融合交叉。53基因芯片技術(shù)第三節(jié)基因芯片基本應(yīng)用1.基因表達(dá)分析2.基因型及多態(tài)性分析3.雜交測序4.疾病的診斷與治療5.藥物研究與開發(fā)6.基因功能研究7.在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用8.在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用9.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)10.軍事和司法11.在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用12.在食品微生物檢測中的應(yīng)用54基因芯片技術(shù)1.基因表達(dá)分析基因表達(dá)譜芯片應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也最成熟。可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在mRNA表達(dá)水平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進(jìn)行描述。55基因芯片技術(shù)2.基因型及多態(tài)性分析利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價固定于玻璃載片上，采用PCR擴增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交，通過熒光掃描檢測雜交模式，即可測定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對人的酪氨酸酶基因第4個外顯子內(nèi)含有的5個單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。56基因芯片技術(shù)3.雜交測序基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法，可以用圖來說明。

57基因芯片技術(shù)基因芯片測序流程58基因芯片技術(shù)4.疾病的診斷與治療基因芯片在尋找和檢測與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測致病基因的表達(dá)、感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)檢測方法相比，它可以在一張芯片上同時對多個病人進(jìn)行多種疾病的檢測；無需機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能及早診斷，待測樣品用量小；能檢測病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型；極高的靈敏度和可靠性；檢測成本低，自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。這些特點使得醫(yī)務(wù)人員在短時間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時間內(nèi)找到正確的治療措施。59基因芯片技術(shù)5.藥物研究與開發(fā)基因芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性等特點可以進(jìn)行新藥的篩選，尤其對我國傳統(tǒng)的中藥有效成分進(jìn)行篩選。目前，國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了基因芯片技術(shù)來尋找藥物靶標(biāo)，查檢藥物的毒性或副作用，用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，在基因組藥學(xué)（pharmacogenomics）領(lǐng)域帶動新藥的研究和開發(fā)。60基因芯片技術(shù)6.基因功能研究在基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究中，基因芯片也起到重要的作用。應(yīng)用基因芯片可以開展DNA測序、基因表達(dá)檢測、基因突變性、基因功能研究、尋找新基因、單核苷酸多態(tài)性（SNP）測定等研究。與傳統(tǒng)的Northernblot雜交或點雜交方法相比，基因芯片技術(shù)具有大規(guī)模平行處理的能力。61基因芯片技術(shù)基因芯片突變檢測原理示意62基因芯片技術(shù)7.在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用采用基因芯片技術(shù)研究營養(yǎng)素與蛋白和基因表達(dá)的關(guān)系，將為揭示肥胖的發(fā)生機制及預(yù)防打下基礎(chǔ)。還可用于營養(yǎng)與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究，如癌基因、抑癌基因的表達(dá)與突變，營養(yǎng)與心腦血管疾病關(guān)系的分子水平研究。再者，食品營養(yǎng)成分的分析、食品中有毒、有害成分的分析和檢測等。63基因芯片技術(shù)8.在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用在環(huán)境保護(hù)上，基因芯片也廣泛的用途，一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。64基因芯片技術(shù)9.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)利用基因芯片技術(shù)，對有重要經(jīng)濟價值的農(nóng)作物和水果等的基因組進(jìn)行大規(guī)模高通量的研究，篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，以開發(fā)高技術(shù)含量、高附加值的新產(chǎn)品。也可利用基因芯片技術(shù)篩選、開發(fā)高效低毒的生物農(nóng)藥。65基因芯片技術(shù)10.軍事和司法美國以有部分公司得到政府的資助開發(fā)生物戰(zhàn)病原體檢測系統(tǒng)。在司法領(lǐng)域，國外的公司正在開發(fā)便攜式DNA芯片檢測裝置，它可以直接在犯罪現(xiàn)場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲的DNA“指紋”進(jìn)行比較，以盡快、準(zhǔn)確的破案。我國上海的司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所第一個“罪犯DNA數(shù)據(jù)庫”在99年9月7日通過了專家鑒定，利用DNA破案將成為一種重要的破案手段。另外，基因芯片還可作親子鑒定等方面的工作。66基因芯片技術(shù)11