無菌檢驗培養(yǎng)基最小檢出量方法驗證實驗

無菌檢驗培養(yǎng)基最小檢出量方法驗證實驗·獸藥典規(guī)定無菌檢驗用培養(yǎng)基靈敏性驗證時接種相應質(zhì)控菌菌落數(shù)為1-50CFU，這個范圍較廣，不能精確的驗證培養(yǎng)基的靈敏性，故為了更精確的對培養(yǎng)基進行驗證，確定其最小檢出量，特進行此方法驗證。名稱質(zhì)控菌流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌酪胨瓊脂（GA）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌葡萄糖蛋白胨（GP）白色念珠球菌、黑曲霉菌材料：名稱廠家批號名稱來源批號活菌數(shù)規(guī)格流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）中海生物150420金黃色葡萄球菌自制2013019.5*105CFU/ml0.5ml/支酪胨瓊脂（GA）中海生物151123銅綠假單胞菌自制2013018*106CFU/ml0.5ml/支葡萄糖蛋白胨（GP）中海生物151026白色念珠球菌自制2013011.6*104CFU/ml0.5ml/支蛋白胨OXOID869398生孢梭菌自制2013018*104CFU/ml0.5ml/支營養(yǎng)瓊脂中海生物160229//////主要試劑配方3.1硫乙醇酸鹽（TG）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基30g，加入1LMILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。3.2酪胨瓊脂（GA）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基42g，加入1LMILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基28g，加入1LMILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。3.4半固體TG培養(yǎng)基：分別取TG培養(yǎng)基30g、GA培養(yǎng)基1g，加入1LMILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。3.50.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100mlMILLIPORE水，溶解后121℃滅菌15min，放置室溫后，置2-8℃保存。實驗方法4.1GA/TG培養(yǎng)基最小檢出量實驗將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表3進行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml的稀釋度,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌每個稀釋度分別接種TG、6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄。同時金黃色葡萄球菌每個稀釋度接種2副營養(yǎng)瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。銅綠假單胞菌每個稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。生孢梭菌每個稀釋度接種2管半固體TG培養(yǎng)基，每管0.2ml菌液,置37℃培養(yǎng)。TG/GA小管配制日期：2016.03.21接種日期：2016.03.23表3銅綠假單胞菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌最小檢出量驗證稀釋方法銅綠假單胞菌管號原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨1011稀釋液ml1ml4.599997.46756加樣量/取原瓶0.5取①1?、??、??、?取⑤4?、??、萑、??、?.5?、?CFU/ml4*1064*1054*1044*103400（計數(shù)）75（計數(shù)）35（計數(shù)）1007550255CFU/0.2ml///////20151051生孢梭菌管號原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨//稀釋液ml1ml4.599934.372.44//加樣量/取原瓶0.5?、??、??、??、??、??、?取③4?、?//CFU/ml4*1044*1034004041007550255//CFU/0.2ml/////20161051//金黃色葡萄球菌管號原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨//稀釋液ml1ml4.54.54.53.755.24.254.2524.5//加樣量/取原瓶0.5?、?.5?、?.5取③1?、??、?.5?、?.5?、??、?.5//CFU/ml4.75*1054.75*1044.75*1034.75*102100755050255//CFU/0.2ml////2015101051//4.2GP培養(yǎng)基最小檢出量實驗將白色念珠球菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表4進行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、2CFU/0.2ml、4CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml的稀釋度，每個稀釋度分別接種GP斜面3支，每支0.2ml置25℃培養(yǎng)箱，每天觀察小管污染情況并記錄。同時每個稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。GP小管配制時間：2016.04.08檢驗日期：2016.04.09—2016.04.16表4白色念珠菌最小檢出量驗證稀釋方法白色念珠菌管號原瓶①②③④⑤⑥⑦⑧稀釋液ml1ml4.594.54.4371.81.8加樣量/取原瓶0.5?、?取②0.5?、??、??、?取③3?、?CFU/ml8000800808252010550CFU/0.2ml////542110接種管號////√√√√√實驗結(jié)果5.1硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基最小檢出量的實驗結(jié)果按照4.1的實驗方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的最小檢出量，結(jié)果見表5、表6、表7。表5金黃色葡萄球菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的最小檢出量時間最終接種菌數(shù)（CFU）1510152037℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）3/30/33/30/33/30/33/30/33/30/3第2天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）3/31/33/33/33/33/33/33/33/33/3培養(yǎng)結(jié)果1/33/33/33/33/3計數(shù)菌數(shù)（CFU)1,03,412.1816.1620,22表6銅綠假單胞菌和生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的最小檢出量時間生孢梭菌最終接種菌數(shù)（CFU）銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）3/30/33/30/33/30/33/30/33/30/31/30/32/30/33/31/33/30/33/30/3第2天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）3/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/32/33/33/33/33/33/33/33/3培養(yǎng)結(jié)果3/33/33/33/33/31/32/33/33/33/3計數(shù)菌數(shù)（CFU)2,29，1026,2429370,00,06,42,24,8結(jié)果表明：硫乙醇酸鹽對金黃色葡萄球菌的最小檢出量為3CFU、對生孢梭菌最小檢出量為2CFU、對銅綠假單胞菌的最小檢出量為2CFU。備注：理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)有一定差異，結(jié)論以實際計數(shù)結(jié)果為準。銅綠假單胞菌實際結(jié)果與計數(shù)結(jié)果差異較大，2次重復試驗均如此。5.2酪胨瓊脂培養(yǎng)基最小檢出量的實驗結(jié)果按照4.1的實驗方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中的最小檢出量，結(jié)果見表7。表7金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中的最小檢出量時間金黃色葡萄球菌最終接種菌數(shù)（CFU）銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃37℃25℃第1天（+）0/30/33/30/33/30/33/30/33/30/30/30/33/30/33/30/33/30/33/30/3第2天（+）2/31/33/32/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第3天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第4天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/30/33/32/33/33/33/33/33/33/3第5天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3第6天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3第7天（+）2/33/33/33/33/33/33/33/33/33/31/31/33/32/33/33/33/33/33/33/3培養(yǎng)結(jié)果2/33/33/33/33/31/32/33/33/33/3計數(shù)菌數(shù)（CFU)1,03,412.1816.161,00,00,06,42,24,8結(jié)果表明：酪胨瓊脂培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌的最小檢出量為3CFU、對銅綠假單胞菌的最小檢出量為2CFU。5.3葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基最小檢出量實驗結(jié)果按照4.2的實驗方法，確定白色念珠球菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中的最小檢出量，結(jié)果見表8。表8白色念珠菌在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的最小檢出量時間白色念珠菌最終接種菌數(shù)（CFU）12451025℃25℃25℃25℃25℃第1天（+）0/30/30/30/30/3第2天（+）0/30/30/30/30/3第3天（+）1/33/33/33/33/3第4天（+）1/33/33/33/33/3第5天（+）1/33/33/33/33/3第6天（+）1/33/33/33/33/3第7天（+）1/33/33/33/33/3觀察結(jié)果1/33/33/33/33/3計數(shù)菌數(shù)（CFU)0，00，01，01，13，3結(jié)果表明：葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基對白色念珠球菌的最小檢出量為1CFU。結(jié)論與分析1.理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)差異問題根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)有一定差異，其中以銅綠假單胞菌差異最大。目前還未找到原因。因為同步計數(shù)菌落數(shù)比理論菌落數(shù)更加接近實際的菌落數(shù)，因此最小檢出量以同步計數(shù)菌落數(shù)來計算。2.最小檢出量的管數(shù)判定問題在實驗過程中，每個稀釋度均接種3個對應的培養(yǎng)基小管，在培養(yǎng)結(jié)束后判定實驗結(jié)果時，是按照3/3全部污染為標準?？墒蔷鋽?shù)較少的稀釋度并不是均不污染，而是污染2/3、1/3管。根據(jù)此現(xiàn)象，推測是因為細菌在樣品中數(shù)量太少，而接種時只吸取0.2ml接種，若0.2ml里有菌落，則能夠檢出；若0.2ml里剛好沒有吸到菌落則檢不出來。因此，若認為每次接種均能夠吸取菌落，則按照實驗結(jié)果，則每一種培養(yǎng)基的最小檢出量均為1個CFU。名稱質(zhì)控菌3/3管最小檢出量2/3管最小檢出量1