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文檔簡介

67.120.10CCS

22

DB36 36/T

1881—2023黑斑側褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術規(guī)范Technical

specification

for

isolation

and

identification

of

Elizabethkingia

miricola

inRana

nigromaculata 江西省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布

18812023

DB36/T

1881—2023

1.1—2020II

18812023

文件用于斑側蛙米伊麗白菌離鑒定，他蛙米爾麗莎菌分鑒定參考

20222022

3.1

Double

pithing3.2

Polymerase

PCR個周期，3.3

sequencing3.4

DB36/T

1881—2023

圖1

18812023

7.1

7.2

24

將培養(yǎng)好的菌懸濁液搖晃均勻，在無菌狀態(tài)下劃線接種于營養(yǎng)瓊脂中，恒溫培養(yǎng)箱（28

24

選取優(yōu)勢菌落接種于新的營養(yǎng)瓊脂，恒溫培養(yǎng)箱（28

24

7.3

7.3.2.1

PCR

0.5

滅菌生理鹽水中，4000

0.5

100

10

4000

離心30

7.3.2.2

PCR

buffer

0.5

10

(2.5

0.2

ddH

12.8

20

7.3.2.3

PCR

16S

95

94

30

55

30

72

90

3272

10

基因擴增條件：95

預變性

94

變性30

55

退火30

72

延伸30

，共32個循72

10

7.3.2.4

擴增產(chǎn)物和

上樣緩沖液，混勻后加入1.2%瓊脂糖凝膠電泳加樣孔中，同時在空白孔加入

標準品。電泳結束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上，打開紫外燈觀察或用凝膠成DB36/T

1881—20237.3.2.5

98%

24

10

7.20.2

15產(chǎn)生典型白內障病癥狀的感染蛙再次進行細菌分離，經(jīng)16S

rDNA基因分子鑒定，所分離的細菌與米爾伊麗莎白菌（

）同源性達到98%以上，則證實分離的病原菌確定為黑斑側褶蛙白內障

為了保護實驗室人員的安全，應由具備專業(yè)知識的人員進行檢測，所有培養(yǎng)物和廢棄物參照

18812023

A.1

無菌工作臺、手持式均質器（適用于

1.5

離心管）、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心

0.01

A.2

90

2.5

μL10

μL100

0.2

）、1.5

2.0

DB36/T

1881—2023

B.1

10.0

5.0

10.0

7.2

0.225

0.2121

15

B.2

10.0

5.0

10.0

15.0

7.2

0.225

制作方法：將上述成分混合，加入雙蒸水或去離子水，調整值至

0.2121

滅菌15

50

B.3

稱取1.2

瓊脂糖，加入100

緩沖溶液中，加入核酸染料，微波爐加熱至完全融化，依據(jù)0.5

B.4

50TAE

242

100

0.5

pH8.01000

B.5

TAE

49B.6

16S

10

16S

27F

5

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