DB36-T 1881-2023 黑斑側(cè)褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范

67.120.10CCS

22

DB36 36/T

1881—2023黑斑側(cè)褶蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范Technical

specification

for

isolation

and

identification

of

Elizabethkingia

miricola

inRana

nigromaculata 江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布

18812023

DB36/T

1881—2023

1.1—2020II

18812023

文件用于斑側(cè)蛙米伊麗白菌離鑒定，他蛙米爾麗莎菌分鑒定參考

20222022

3.1

Double

pithing3.2

Polymerase

PCR個(gè)周期，3.3

sequencing3.4

DB36/T

1881—2023

圖1

18812023

7.1

7.2

24

將培養(yǎng)好的菌懸濁液搖晃均勻，在無(wú)菌狀態(tài)下劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，恒溫培養(yǎng)箱（28

24

選取優(yōu)勢(shì)菌落接種于新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，恒溫培養(yǎng)箱（28

24

7.3

7.3.2.1

PCR

0.5

滅菌生理鹽水中，4000

0.5

100

10

4000

離心30

7.3.2.2

PCR

buffer

0.5

10

(2.5

0.2

ddH

12.8

20

7.3.2.3

PCR

16S

95

94

30

55

30

72

90

3272

10

基因擴(kuò)增條件：95

預(yù)變性

94

變性30

55

退火30

72

延伸30

，共32個(gè)循72

10

7.3.2.4

擴(kuò)增產(chǎn)物和

上樣緩沖液，混勻后加入1.2%瓊脂糖凝膠電泳加樣孔中，同時(shí)在空白孔加入

標(biāo)準(zhǔn)品。電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上，打開(kāi)紫外燈觀(guān)察或用凝膠成DB36/T

1881—20237.3.2.5

98%

24

10

7.20.2

15產(chǎn)生典型白內(nèi)障病癥狀的感染蛙再次進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)16S

rDNA基因分子鑒定，所分離的細(xì)菌與米爾伊麗莎白菌（

）同源性達(dá)到98%以上，則證實(shí)分離的病原菌確定為黑斑側(cè)褶蛙白內(nèi)障

為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員進(jìn)行檢測(cè)，所有培養(yǎng)物和廢棄物參照

18812023

A.1

無(wú)菌工作臺(tái)、手持式均質(zhì)器（適用于

1.5

離心管）、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心

0.01

A.2

90

2.5

μL10

μL100

0.2

）、1.5

2.0

DB36/T

1881—2023

B.1

10.0

5.0

10.0

7.2

0.225

0.2121

15

B.2

10.0

5.0

10.0

15.0

7.2

0.225

制作方法：將上述成分混合，加入雙蒸水或去離子水，調(diào)整值至

0.2121

滅菌15

50

B.3

稱(chēng)取1.2

瓊脂糖，加入100

緩沖溶液中，加入核酸染料，微波爐加熱至完全融化，依據(jù)0.5

B.4

50TAE

242

100

0.5

pH8.01000

B.5

TAE

49B.6

16S

10

16S

27F

5