磷對(duì)有毒甲藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒力的影響

磷對(duì)有毒甲藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒力的影響

近年來(lái)，有害赤潮的發(fā)生頻率、程度和危害日益嚴(yán)重，已成為一個(gè)全球問(wèn)題（hualgaief，1993；周明江等，2003；嚴(yán)天等，2003）。能引發(fā)赤潮的海洋藻類有260多種,其中70多種能產(chǎn)生毒素(王煥玲等,2008)。塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和微小亞歷山大藻(Alexandtiumminutum)是2種重要的有毒甲藻,其產(chǎn)生的麻痹性貝毒是世界范圍內(nèi)分布最廣、危害最嚴(yán)重的一類毒素(于仁誠(chéng)等,1998),它們與大多數(shù)麻痹性貝毒中毒事件密切相關(guān)。在我國(guó)大部分海域有發(fā)生赤潮的記錄(齊雨藻等,1994;1996;林元燒,1996;周宏農(nóng),1999),它們也是我國(guó)主要的赤潮甲藻種。能夠產(chǎn)生麻痹性貝毒的甲藻的生長(zhǎng)和毒性受各種環(huán)境因子影響,其中營(yíng)養(yǎng)鹽的影響非常顯著(Selanderetal,2008)。從20世紀(jì)90年代初開始,氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)甲藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒能力的影響受到關(guān)注(Andersonetal,1990)。以往研究多集中于含氮營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)甲藻的影響(張清春等,2005a),盡管關(guān)于磷對(duì)藻類生長(zhǎng)影響的研究有很多報(bào)道(Hallegraeff,2010),且Ikegami等(1995)對(duì)天然海水和人工海水培養(yǎng)的鞭毛藻的研究表明,無(wú)機(jī)磷在赤潮藻種增殖中具有重要性,但關(guān)于磷對(duì)赤潮甲藻增殖和有毒藻類產(chǎn)毒的影響研究仍相對(duì)較少。本文以塔瑪亞歷山大藻和微小亞歷山大藻2種有毒甲藻為試驗(yàn)對(duì)象,研究不同磷濃度對(duì)其生長(zhǎng)及產(chǎn)毒力的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)材料塔瑪亞歷山大藻編號(hào)ATCI01,存于暨南大學(xué)水生生物研究所藻種室。微小亞歷山大藻取自臺(tái)灣。1.1.2混合纖維濾膜的制備培養(yǎng)用海水取自集美大學(xué)海水試驗(yàn)場(chǎng)天然海水,海水鹽度28～29,經(jīng)孔徑為0.45μm的混合纖維濾膜過(guò)濾,120℃高壓濕熱滅菌20min,室溫冷卻后添加營(yíng)養(yǎng)鹽備用。試驗(yàn)藻類培養(yǎng)溫度為(20±1)℃,光照強(qiáng)度為3500～4000lx,光暗比(L∶D)為12h∶12h。1.1.3忽略不記之時(shí)配制f/2培養(yǎng)液的海水取自廈門海域,其磷的含量約0.03μmol/L,試驗(yàn)中忽略不記。磷濃度設(shè)置4個(gè)梯度,以海水配制的f/2營(yíng)養(yǎng)液為基礎(chǔ),分別設(shè)置不添加NaH2PO4、添加50%NaH2PO4、添加100%NaH2PO4和添加150%NaH2PO4,其磷濃度分別為0、1.8、3.6和5.4μmol/L。1.2方法1.2.1培養(yǎng)液的制備2種有毒甲藻分別用4個(gè)梯度的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每個(gè)磷濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在500mL三角燒瓶中進(jìn)行,培養(yǎng)液300mL。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的塔瑪亞歷山大藻和微小亞歷山大藻接種到三角燒瓶?jī)?nèi),接種密度400個(gè)/mL,進(jìn)行一次性培養(yǎng)。取樣時(shí),將盛培養(yǎng)物的三角瓶搖勻,取2mL培養(yǎng)物用碘液固定后在顯微鏡下計(jì)數(shù),重復(fù)3次,計(jì)數(shù)值間相差應(yīng)小于15%,取2次相近數(shù)據(jù)的平均值為試驗(yàn)結(jié)果。1.2.2藻毒力試驗(yàn)原液的制備藻培養(yǎng)到第7天時(shí)收集,以2500g離心10min,棄掉上清液,加入5mL的0.01mol/LHCl并以1mol/LNaOH調(diào)整其pH處于3～4,在冰水浴中超聲破碎5～8min后鏡檢,當(dāng)細(xì)胞全部破碎后,將其置于沸水中水浴5min,冷卻至室溫后,用0.01mol/LHCl和1mol/LNaOH調(diào)整其pH為3,再以蒸餾水定容至5mL,3000g離心10min,取上清液作藻毒力試驗(yàn)的原液。1.2.3藻細(xì)胞毒力試驗(yàn)依美國(guó)AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)(1980)推薦的方法進(jìn)行藻毒力試驗(yàn)。取1mL上述試驗(yàn)原液,腹腔注射小白鼠(昆明種,雄性,購(gòu)自廈門大學(xué)抗癌中心),記錄其死亡時(shí)間,再依Sommer′sTable換算成毒力(AOAC,1980)。重復(fù)3次,取平均值為試驗(yàn)結(jié)果。本文用鼠單位表示藻細(xì)胞毒力的大小。鼠單位(Mouseunit簡(jiǎn)稱Mu)是國(guó)際上用于表示麻痹性貝毒素毒力的單位,定義為一只重20g的小白鼠在15min內(nèi)死亡所需腹腔注射的劑量。根據(jù)藻毒力預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將上述試驗(yàn)原液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋,將小白鼠的死亡時(shí)間調(diào)整至5～7min。根據(jù)死亡時(shí)間和小白鼠體重,按Sommer′sTable的死亡時(shí)間和體重修正表計(jì)算后,取平均值為試驗(yàn)結(jié)果。1.2.4藻細(xì)胞密度和形態(tài)觀察在接種后每天從各三角燒瓶中取1mL,加1～2滴魯哥氏液固定藻細(xì)胞,以浮游生物計(jì)數(shù)框在顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞,并計(jì)算密度。同時(shí),取少量藻細(xì)胞在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài),并用目微尺測(cè)量其大小。每個(gè)樣品測(cè)量30個(gè)藻細(xì)胞,取平均值。1.2.5數(shù)據(jù)分析獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行處理分析,進(jìn)行單因素方差分析(OneWayANOVA),并用最小顯著差法(LSD)進(jìn)行多重比較。2結(jié)果2.1接種密度和密度對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響塔瑪亞歷山大藻和微小亞力山大藻在不同磷濃度下的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。接種后1～4d,藻細(xì)胞生長(zhǎng)比較遲緩。塔瑪亞歷山大藻在0μmol/L磷濃度下藻細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停滯,一直保持在接種密度;其他磷濃度下塔瑪亞歷山大藻在4d后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,在6d和7d時(shí),3.6μmol/L磷濃度組的塔瑪亞歷山大藻密度顯著高于1.8和5.4μmol/L磷濃度組(P<0.05)。微小亞力山大藻在1.8、3.6和5.4μmol/L磷濃度下生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(P>0.05),但在0μmol/L磷濃度下生長(zhǎng)緩慢,藻密度顯著低于其他3個(gè)有磷組(P<0.05)。2.2總磷濃度對(duì)小亞力山大藻產(chǎn)毒能力的影響塔瑪亞歷山大藻和微小亞力山大藻在不同磷濃度下的產(chǎn)毒能力見(jiàn)圖2。塔瑪亞歷山大藻在0μmol/L磷濃度下平均產(chǎn)毒能力最高,為3.0×10-4MU/個(gè),顯著高于其他磷濃度組(P<0.05);3.6μmol/L磷濃度下平均產(chǎn)毒能力最低,為0.1×10-4MU/個(gè),顯著低于其他磷濃度組(P<0.05);1.8和5.4μmol/L磷濃度下的平均產(chǎn)毒能力居中,分別為0.4×10-4和0.6×10-4MU/個(gè),2者之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。微小亞力山大藻在0μmol/L磷濃度下平均產(chǎn)毒能力最高,為5.2×10-4MU/個(gè),顯著高于其他3個(gè)磷濃度組(P<0.05);其他3個(gè)磷濃度組的平均產(chǎn)毒能力沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。2.3小球藻細(xì)胞磷代謝前后比對(duì)不同磷濃度下塔瑪亞歷山大藻和微小亞歷山大藻的細(xì)胞大小見(jiàn)表1。塔瑪亞歷山大藻和微小亞歷山大藻都是在0μmol/L磷濃度下具有較大的藻細(xì)胞,顯著高于其他3個(gè)磷濃度組(P>0.05)。在0μmol/L磷濃度下細(xì)胞大而圓,加碘液固定時(shí)顏色較深,藻細(xì)胞內(nèi)顆粒清晰。3討論3.1不同濃度磷對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和分布的影響海水中的營(yíng)養(yǎng)鹽是浮游植物生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ),大多數(shù)赤潮藻類都具有吸收無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力(黃世玉等,1997;Hallegraeff,2010)。已有研究表明,磷對(duì)亞歷山大藻的生長(zhǎng)有明顯影響(張宜輝等,1999;曾江寧等,2004;張清春等,2005b;楊陽(yáng)等,2008;劉瀟等,2008;繆宇平等,2009)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明,培養(yǎng)液中含有磷時(shí)能夠促進(jìn)2種亞歷山大藻的生長(zhǎng),在磷限制的情況下(0μmol/L),2種藻生長(zhǎng)緩慢,而在有磷補(bǔ)充的情況下生長(zhǎng)快速,這與以往的研究結(jié)果一致(Kurtenetal,2007;劉瀟等,2008)。本試驗(yàn)最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為7d,而類似的研究一般培養(yǎng)時(shí)間為20～30d,在接種后13～19d,2種亞歷山大藻才能達(dá)到最大的藻細(xì)胞密度(張清春等,2005a;張清春等,2005b;繆宇平等,2009)。2種亞歷山大藻培養(yǎng)7d處于指數(shù)生長(zhǎng)初期,不同濃度磷對(duì)其生長(zhǎng)的影響有所差異。微小亞歷山大藻處于指數(shù)生長(zhǎng)初期時(shí),磷營(yíng)養(yǎng)鹽不是限制因子,所以在添加磷1.8、3.6和5.4μmol/L的情況下,其生長(zhǎng)沒(méi)有差異。塔瑪亞歷山大藻則受到磷濃度影響,以往的研究表明無(wú)機(jī)磷對(duì)塔瑪亞歷山大藻增值的最適濃度為4.0～4.5μmol/L,在低于最適無(wú)機(jī)磷濃度時(shí),隨無(wú)機(jī)磷濃度的增大,塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞迅速增殖,當(dāng)高于5.0μmol/L時(shí),藻細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制(張宜輝等,1999)。塔瑪亞歷山大藻在沒(méi)有添加磷營(yíng)養(yǎng)鹽時(shí),磷成為限制因子,所以生長(zhǎng)速率顯著低于其他3個(gè)磷濃度組;3.6μmol/L接近塔瑪亞歷山大藻最適磷濃度,所以具有最高的細(xì)胞密度;而1.8μmol/L尚未達(dá)到最適磷濃度,細(xì)胞密度較低,5.4μmol/L超過(guò)最適磷濃度,藻細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,也具有較低的藻細(xì)胞密度。3.2細(xì)胞內(nèi)氮代謝李瑞丹等(2010)研究表明,氮磷比例對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力有顯著影響。磷對(duì)毒素合成的影響有可能是通過(guò)一個(gè)間接的過(guò)程,即通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的氮代謝影響毒素的合成(于仁誠(chéng),等1998)。在磷限制條件下,2種亞歷山大藻的藻細(xì)胞大小顯著高于添加磷的試驗(yàn)組,這表明在磷限制條件下,藻細(xì)胞積累的物質(zhì)增多,其中與產(chǎn)毒相關(guān)的各種酶和毒素也相應(yīng)增多,這也是藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力增加的原因之一。3.3不同濃度磷限制條件下藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力貝毒的檢測(cè)方法主要包括生物檢測(cè)法和化學(xué)檢測(cè)法。小鼠生物法是目前所有實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,該方法以產(chǎn)毒力表示檢測(cè)結(jié)果,是一種生物檢測(cè)法;高效液相色譜法是化學(xué)檢測(cè)方法的代表,具有直接定量貝毒的優(yōu)點(diǎn),被很多研究所采用,該方法以產(chǎn)毒量表示檢測(cè)結(jié)果。本文采用小鼠生物法