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茶葉中茶多酚的提取工藝研究
茶是人們?nèi)粘I钪谐R?jiàn)的保健飲料。它是世界上最重要的茶產(chǎn)區(qū)之一,也是發(fā)現(xiàn)和使用茶葉的國(guó)家。茶葉(Camelliasinensis.L)的藥用價(jià)值歷史悠久,歷代藥書中均有茶葉入藥的記載,中國(guó)茶書和中醫(yī)古籍,對(duì)茶的醫(yī)療保健作用,都是高度重視和推崇,現(xiàn)存最早的藥物經(jīng)典《神農(nóng)本草經(jīng)》記載:“神農(nóng)嘗百草,日遇七十二毒,得茶乃解”。唐代陳藏器在《本草拾遺》中說(shuō):“諸藥為各病之藥,茶為萬(wàn)病之藥”。明朝李時(shí)珍在《本草綱目》中記載說(shuō):“茶苦而寒,最能降火,火為百病之因,火降則百病清也”,顧元慶《茶譜》記載:“飲茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目益思、除煩、去膩,人固不可一日無(wú)茶”。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外的大量研究表明,茶葉具有抗癌、抗突變、抗衰老、消除自由基、抗氧化[6~7]、降血壓、降血脂[8~9]、降血糖乃至抗艾滋病等多種功效。說(shuō)明茶具有獨(dú)特的藥理作用,該作用是由茶葉中特定的化學(xué)成分決定的。研究表明,在這些物質(zhì)中起主導(dǎo)作用的是一種多羥基酚類物質(zhì),即茶多酚(Tea-Polyphenols,簡(jiǎn)稱TP)。茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物的混合物,簡(jiǎn)稱茶多酚,俗名茶單寧、茶鞣質(zhì)。茶多酚純品為白色無(wú)定形粉末,易溶于熱水,可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑,微溶于油脂。難溶于苯、氯仿、石油醚。兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分,也是茶葉的特有成分[11~12]。茶多酚中幾種含量較高的兒茶素分別是:左旋-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(L-EGCG),左旋–表兒茶素沒(méi)食子酸酯(L-ECG),左旋-表沒(méi)食子兒茶素(L-EGC),左旋-表兒茶素(L-EC)。茶多酚是一類具有2-連(或鄰)苯酚基苯并吡喃衍生物,其結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。本文從不同溶劑、不同提取方法等多重影響因素下提取茶多酚,茶多酚的檢測(cè)原理是依據(jù)《GB/T8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》,福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色在波長(zhǎng)λ=765nm處有最大吸收峰,用沒(méi)食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚。用紫外-見(jiàn)分光光度法分析測(cè)定茶多酚的溶出量,對(duì)茶多酚的溶出量進(jìn)行對(duì)比,以期能為茶葉中茶多酚的提取、分析測(cè)定有一定幫助。1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備1.1試劑、標(biāo)準(zhǔn)水和儀器市售綠茶與發(fā)酵茶樣品;福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑(Sigma-Aldrich公司F9252);無(wú)水碳酸鈉;沒(méi)食子酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110931-200302);水為實(shí)驗(yàn)室自制重蒸餾水;其余試劑均為分析純。1.2da與tgl-10b型高速離心檢測(cè)儀器島津UV-160A型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì);XMT-DA數(shù)顯恒溫水浴鍋;島津AEL-200型電子分析天平;TGL-10B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);HU10300F超聲波清洗器(天津恒奧)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液na2co310%福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑(現(xiàn)配)將20mL福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶中,用水定容并搖勻即得。7.5%Na2CO3溶液配制稱取(37.50±0.01)gNa2CO3,加水適量使溶解,轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中,定容至刻度并搖勻即得。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1000ug/mL現(xiàn)配)稱取(0.025±0.001)g沒(méi)食子酸(GA,相對(duì)分子質(zhì)量188.14),于25mL容量瓶中加水適量使溶解,并定容至刻度,搖勻即得。沒(méi)食子酸工作液用移液管分別移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100mL容量瓶中,分別用水定容至刻度,搖勻,10,20,30,40,50ug/mL。2.2試驗(yàn)溶液的制備2.2.1提取過(guò)程中茶多酚提取物的制備精密稱取粉碎后綠茶、發(fā)酵茶樣品3.0g(精確到0.0001g),分別加入20mL溶劑(H2O、70%乙醇、30%乙醇)分別以超聲30min、加熱回流30min、溫浸30min、70℃溫浸24h、常溫浸提48h(重復(fù)提取3次)提取茶多酚,提取結(jié)束后在70℃下蒸干提取劑,即得茶多酚粗提物。2.2.3液體測(cè)試2.3測(cè)量2.3.1福林酚的合成用移液管分別移取沒(méi)食子酸工作液、水(作空白對(duì)照用)及測(cè)試液各1.0mL于刻度試管內(nèi),在每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0mL的10%福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑,搖勻。反應(yīng)4min后,加入4.0mL7.5%Na2CO3溶液,加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60min。用10mm比色皿、在765nm波長(zhǎng)條件下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A)。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按測(cè)定方法“4.3.1”根據(jù)沒(méi)食子酸工作液的吸光度(A)與各工作液的沒(méi)食子酸濃度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖2?;貧w方程為:y=0.1086x+0.0093(R2=0.9987)。2.3.3計(jì)算茶多酚100%的成本式中:C:測(cè)得的沒(méi)食子酸濃度;d:稀釋倍數(shù);m:茶多酚粗提物取樣量。3超聲、溫浸提取茶多酚粗提物的得率與樣品中茶多酚的含量分別如表2、表3所示:3.1綠茶與發(fā)酵茶提取所得茶多酚溶出量對(duì)比,在以上3種提取溶劑和五種提取方式中,綠茶中的茶多酚含量要遠(yuǎn)高于發(fā)酵茶中的茶多酚含量,而其中尤以超聲和溫浸3次提取出的茶多酚高于其它3種提取方式。3.2綠茶與發(fā)酵茶超聲提取、加熱回流得率與茶多酚溶出量對(duì)比,在兩種提取方式下高濃度乙醇提取出的茶多酚要高于低濃度乙醇和水提取的茶多酚,其中水提出的茶多酚量最少,而兩種提取方式比較下,超聲提取比加熱回流提取的提取率要稍高。3.3綠茶與發(fā)酵茶70℃溫浸30min(3次)、70℃溫浸24h、常溫浸提48h提取得率與茶多酚溶出量對(duì)比,高濃度乙醇提取出的茶多酚較高,低濃度乙醇和水提取的茶多酚溶出量相接近,茶多酚的含量在3種提取方式下未表現(xiàn)出明顯的差異,而以70℃溫浸30min(3次)提取的茶多酚要略高于其他兩種方法。4動(dòng)態(tài)平衡濾出溶液主要受壓迫樣品,細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)部滲透,細(xì)胞內(nèi)部滲透,細(xì)胞內(nèi)部滲透,細(xì)胞內(nèi)部滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)滲透,細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)植物有效成分溶劑提取的原理是:根據(jù)植物中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì),用對(duì)有效成分溶解度大,對(duì)無(wú)效成分溶解度小的溶劑將有效成分從植物組織中溶出,當(dāng)溶劑加到植物原料中時(shí),溶劑擴(kuò)散滲透通過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),可溶性物質(zhì)溶解,造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差,以此為推動(dòng)力使細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)向溶液主體擴(kuò)散,至細(xì)胞內(nèi)外有效成分濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡濾出溶液。4.1增加茶多酚的溶出量4.1.1提取速率的研究有效成分濃度差是推動(dòng)提取進(jìn)行的主要因素,根據(jù)Fick第一擴(kuò)散定律,濃度差越大,提取的傳質(zhì)推動(dòng)力就越大,提取速率就越快,實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為采用多次重復(fù)浸提。4.1.2超聲波提取法加強(qiáng)兩相間的相對(duì)運(yùn)動(dòng),可以減少固相邊界上液膜的厚度降低邊界層阻力,并使液膜不斷更新,從而提高濃度差,增大提取推動(dòng)力提高傳質(zhì)速率,實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為采用超聲波提取。4.1.3提取溫度對(duì)ein的影響對(duì)大多數(shù)物質(zhì)而言,升高溫度可以加大物質(zhì)的溶解度,而且根據(jù)Stokes—Einstein公式可知溫度升高,溶液黏度下降,擴(kuò)散系數(shù)就增大,可提高有效成分的擴(kuò)散速率,從而提高提取速率,溫度升高,擴(kuò)散系數(shù)增大,但是溫度太高又會(huì)使過(guò)多的雜質(zhì)同時(shí)提出,或者對(duì)熱敏性有效成分有破壞作用,實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為加熱回流提取和70℃溫浸浸提。4.2在實(shí)驗(yàn)中,提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)4.2.1熱壓提取法該法是將物料粉碎后裝入容器中加入溶劑浸漬物料以溶出有效成分的方法,在常溫下進(jìn)行,尤其適用于有效成分遇熱易破壞及易揮發(fā)的物料,但整個(gè)過(guò)程處于靜止?fàn)顟B(tài),提取溫度低,有效成分溶解度和傳質(zhì)速率小,存在著提取率低,提取周期長(zhǎng),提取液易發(fā)霉變質(zhì)等缺點(diǎn)。4.2.2提取溶劑回用法該法是在進(jìn)行加熱提取時(shí)采用循環(huán)冷卻裝置,使溶劑連續(xù)回流,使植物有效成分充分提出的方法,該法溶劑用量少提取率高,但對(duì)于受熱易破壞的成分提取不適用。4.2.3加熱回流提取的茶多酚對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響超聲波浸提是利用超聲波的機(jī)械破碎和空化作用,物料周圍空穴形成、增大和閉合回產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力,使細(xì)胞破碎,增加有效成分的溶出速度和數(shù)量,加速茶多酚等浸提物從茶葉向溶劑的擴(kuò)散速度,從而提高了有效成分的浸提率,縮短浸提時(shí)間,超聲波浸提的最大優(yōu)點(diǎn)就是浸提所需的時(shí)間短,因此避免了長(zhǎng)時(shí)間處于高溫下茶多酚的氧化,收率和產(chǎn)品質(zhì)量都較傳統(tǒng)方法高。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,綠茶中提取出的茶多酚要高于在發(fā)酵茶中提出的茶多酚,這是由于發(fā)酵茶在加工過(guò)程中有著一定程度的兒茶素?fù)p失。以超聲和加熱回流提取出茶多酚的溶出量比較,二者同樣加大材料顆粒與溶劑固液兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng),但加熱回流提取出的茶多酚反而不如超聲提取出的茶多酚,這可能存在的原因是加熱回流過(guò)程中的溫度過(guò)高,茶多酚受熱氧化損失。又以70℃多次重復(fù)提取與70℃溫浸兩種提取方式所得茶多酚比較,多次重復(fù)提取所得要高于70℃溫浸,這是多次重復(fù)提取法通過(guò)多次添加溶劑增加了主體溶液與相界面之間有效成分的濃度差使得茶多酚能通過(guò)濃度差盡快的溶于提取溶劑中,加大了提取效率,而70℃溫浸在茶多酚溶出一定量后主體溶液與相界面之間有效成分的濃度差變得極小,茶多酚溶出速度變緩或不繼續(xù)溶出,兩種方法比較,多次重復(fù)提取耗時(shí)短、易操作、提取率高優(yōu)于70℃溫浸,兩種方法優(yōu)選多次重復(fù)提取。2.2.2棒汁制備工藝稱取0.2g(精確到0.0001g)茶多酚粗提物于10mL離心管中,加入在70℃中預(yù)熱過(guò)的70%甲醇溶
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