玉米第二真葉下表皮鈣離子濃度的變化及來源探討

玉米第二真葉下表皮鈣離子濃度的變化及來源探討

0ca2+的生物生態(tài)學(xué)特性在植物體內(nèi)，ca2作為第二信號的第二信號，參與了許多環(huán)境刺激引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種刺激因素，如機械刺激、低溫、紅光、植物激素、真菌激生子、缺氧和水提取物。大多數(shù)時候，共同語言中的ca2+濃度會發(fā)生顯著變化。【前人研究進展】植物細(xì)胞內(nèi),Ca2+分布是不均勻的,靜息細(xì)胞的Ca2+濃度保持在30~200nmol·L-1,處于一種比較穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度較低,小于或等于0.1μmol·L-1,而細(xì)胞壁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中Ca2+濃度要比胞質(zhì)高2個數(shù)量級以上(液泡Ca2+濃度為10-3mol·L-1、質(zhì)外體Ca2+濃度為10-4~10-3mol·L-1)。這些部位或細(xì)胞器稱為細(xì)胞的鈣庫,胞外鈣庫是細(xì)胞壁,胞內(nèi)鈣庫包括液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等。研究表明:細(xì)胞受刺激后,胞質(zhì)Ca2+濃度有一個短暫的、明顯的升高。胞質(zhì)Ca2+濃度增加,來源于胞外和胞內(nèi)鈣庫,胞外的Ca2+可以順化學(xué)勢梯度通過質(zhì)膜上的Ca2+通道進入細(xì)胞質(zhì),胞內(nèi)Ca2+也同樣可通過內(nèi)膜上的Ca2+通道進入胞質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c】植物細(xì)胞在如此眾多因素刺激下,都使用細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為第二信使,調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育、抗逆等生理反應(yīng)。為什么這種簡單的離子變化能夠調(diào)控如此多的生理反應(yīng)?對于干旱信號ABA的刺激,胞質(zhì)鈣離子又是如何反應(yīng)的呢?【擬解決的關(guān)鍵問題】筆者以玉米為材料,通過數(shù)字激光共聚焦顯微鏡對保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)鈣離子濃度變化的跟蹤測定,試圖進一步揭示ABA在引起保衛(wèi)細(xì)胞氣孔關(guān)閉過程中的胞質(zhì)鈣離子變化特征,同時對鈣離子來源進行初步探討。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1試驗材料1.1.2苗床或或干催芽選取籽粒飽滿的種子,用0.1%HgCl2消毒10min,自來水反復(fù)沖洗,浸種24h后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。芽長至1cm時播種于蛭石中,第二真葉完全伸展時取樣。1.2方法1.2.1氣孔孔徑測量撕取葉片下表皮,用毛筆輕輕刷去殘存的葉肉細(xì)胞,在50mmol·L-1KCl(10mmol·L-1MES,pH6.1)溶液中照光90min,使氣孔完全開放,再轉(zhuǎn)入50μmol·L-1ABA或ABA+EGTA,ABA+異搏啶(10mmol·L-1MES,pH6.1)溶液中,在室內(nèi)光照條件下,于處理1h后觀察、測量孔徑;每個表皮條取5個視野,每個視野測量10個氣孔的孔徑。實驗重復(fù)3次,取平均值。1.2.2fluo-3ammolec的制備選取生長良好的玉米第二真葉,置于MES緩沖液中照光2h,使氣孔開放。撕取下表皮,置于MES緩沖液中,加入fluo-3AM(molecularprobes產(chǎn)品,無水DMSO配母液)使終濃度達10μmol·L-1,在4℃細(xì)胞壁酯酶活性很低的情況下,黑暗孵育2h左右。1.2.3a溶液配制孵育好的表皮條處理方法:(1)直接加入50μmol·L-1ABA處理;(2)在2mmol·L-1EGTA溶液(10mmol·L-1MES,50mmol·L-1KCl,pH6.1)中避光放置30min,再用50μmol·L-1ABA處理;(3)在100μmol·L-1異博啶(10mmol·L-1MES,50mmol·L-1KCl,pH6.1)中避光放置30min,再用50μmol·L-1ABA處理。1.2.4熒光變化圖像檢測處理好的表皮條置于顯微鏡下觀察,熒光鏡下找到視野,用數(shù)字離子測定儀掃描,波長484nm激發(fā),冷CCD接收,在Timecourse下記錄不同區(qū)域的熒光變化圖像及數(shù)據(jù)。待掃出平穩(wěn)曲線后(100s左右),加入藥劑處理,繼續(xù)記錄熒光變化圖像及數(shù)據(jù)。用Excel進行數(shù)據(jù)處理,作曲線圖(每個處理至少10次重復(fù))。2結(jié)果與分析2.1不同處理對玉米氣孔孔徑的影響ABA能夠誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉已經(jīng)被眾多試驗所證實。筆者的試驗中以50μmol·L-1ABA處理玉米表皮時,60min后,與對照相比,ABA處理過的氣孔孔徑平均為對照的10%(圖1),但氣孔孔徑的變化并不是一致的,統(tǒng)計顯示,約85%氣孔完全關(guān)閉,約12%氣孔孔徑變小,接近3%的氣孔孔徑無變化。由圖2可以看出,EGTA+ABA,異搏啶+ABA處理玉米表皮后,都使氣孔孔徑變小,但與ABA處理結(jié)果相比,EGTA+ABA、異搏啶+ABA處理減緩了氣孔的關(guān)閉速度,處理1h后,EGTA+ABA、異搏啶+ABA處理的氣孔平均孔徑分別是ABA處理后孔徑的2倍和1.5倍。這說明Ca2+(EGTA可以螯合質(zhì)外體的Ca2+,異搏啶是質(zhì)膜鈣通道的抑制劑,影響Ca2+的內(nèi)流)在ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中具有一定的作用。2.2保護細(xì)胞[ca2]cyt的變化2.2.1保肝相對熒光變化將裝載了fluo-3AM的表皮條置于載玻片上,在數(shù)字激光共聚焦下觀察保衛(wèi)細(xì)胞的熒光變化。在10min之內(nèi)玉米保衛(wèi)細(xì)胞相對熒光強度穩(wěn)定,相對熒光強度變化僅發(fā)生在±5%范圍內(nèi)(圖3);圖7-Ⅰ顯示了保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt變化過程中熒光變化圖像。這說明在無外界刺激時保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt相對穩(wěn)定。2.2.2aba對衛(wèi)細(xì)胞熒光強度的影響加入ABA觀察測定。觀察發(fā)現(xiàn),加入3μlABA處理保衛(wèi)細(xì)胞后,少數(shù)保衛(wèi)細(xì)胞熒光強度不發(fā)生變化,大部分細(xì)胞熒光強度明顯變強;相對熒光強度數(shù)據(jù)分析表明,約有13%的保衛(wèi)細(xì)胞熒光強度在加入ABA后無明顯的反應(yīng)(圖4-a);87%的保衛(wèi)細(xì)胞熒光強度有明顯的變化,而這些保衛(wèi)細(xì)胞對ABA的反應(yīng)又表現(xiàn)出不同的特性,一部分細(xì)胞在ABA處理后,相對熒光強度迅速升高,200s后相對熒光強度達到163%,600s內(nèi)能維持此熒光強度;另一部分細(xì)胞在ABA處理后,相對熒光強度則逐漸緩慢升高,600s內(nèi)熒光強度達到124%。這些結(jié)果暗示:玉米下表皮不同的保衛(wèi)細(xì)胞對ABA的敏感性存在差異,ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)[Ca2+]cyt的變化呈現(xiàn)多樣性(圖4-b,c,圖7-Ⅱ)。2.2.3aba誘導(dǎo)的觀點對保護方式的影響異搏啶為Ca2+通道的抑制劑,一般應(yīng)用此抑制劑處理細(xì)胞來觀察胞質(zhì)鈣離子升高過程中是否存在鈣離子內(nèi)流問題。本試驗中異搏啶預(yù)處理玉米表皮條后,熒光強度圖像顯示,ABA仍能誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞的熒光強度增強,與單獨ABA處理結(jié)果相同(圖7-Ⅲ);相對熒光強度數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,異搏啶預(yù)處理后,ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞相對熒光強度的變化仍存在3種形式:(a)少數(shù)保衛(wèi)細(xì)胞熒光強度無明顯變化,僅有微小振蕩;(b)加入ABA后,300s內(nèi)相對熒光強度達到122%,并且600s內(nèi)能夠維持此熒光強度;(c)加入ABA后,熒光強度逐漸升高,600s內(nèi)相對熒光強度達到132%(圖5)。這些結(jié)果說明:異搏啶預(yù)處理未影響到ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞胞質(zhì)[Ca2+]cyt的變化形式,但卻造成其[Ca2+]cyt的升幅減小。2.2.4不同處理對玉米紅酵母細(xì)胞熒光強度的影響EGTA作為二價陽離子的螯合劑,可以很好的螯合細(xì)胞壁及質(zhì)外體的鈣離子。當(dāng)用ABA處理表皮條時,可使保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt增加,但是ABA處理以前,用EGTA預(yù)處理玉米表皮條30min,ABA誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞熒光強度增加完全被抑制,其熒光強度變化曲線近乎一條直線(圖6,圖7-Ⅳ)。這說明EGTA螯合了胞外鈣離子,ABA引起的保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt升高受到抑制,暗示[Ca2+]cyt升高過程中鈣離子可能主要來源于胞外。3討論3.1不同保護模式對aba表達的影響鈣離子作為第二信使,在植物細(xì)胞中調(diào)控著許多生理過程,如氣孔關(guān)閉、植物趨向性生長、花粉管生長、某些基因的表達及一些依賴鈣離子的酶的活性變化。本試驗中,50μmol·L-1ABA處理后,保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt對其反應(yīng)出不同的敏感性:部分細(xì)胞對ABA不敏感,而對ABA敏感的保衛(wèi)細(xì)胞中,其[Ca2+]cyt變化又表現(xiàn)出不同的動態(tài)曲線。在氣孔運動觀察過程中,不同的氣孔對ABA的反應(yīng)也表現(xiàn)出不同,ABA處理后,大部分氣孔關(guān)閉,少數(shù)氣孔仍然開放。McAinsh在1990年就已證實保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt升高先于ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。那么這就暗示:不同保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt對ABA的不同變化模式可能造成了氣孔對ABA反應(yīng)的差異,ABA處理后,[Ca2+]cyt無明顯變化的保衛(wèi)細(xì)胞,氣孔不關(guān)閉;ABA處理后,[Ca2+]cyt升高(無論哪種形式的升高),氣孔關(guān)閉。對于同一刺激為什么植物會表現(xiàn)出不同的[Ca2+]cyt變化呢?Trewavas的解釋是:葉片上的保衛(wèi)細(xì)胞不是同步發(fā)育完成的,每一個保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生的時間,以及在發(fā)育過程中遇到的外界環(huán)境都與其它細(xì)胞不同,所以每個成熟的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞都含有其獨有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白組成方式,并采用其特有的方式感受外界刺激,并作出反應(yīng)。因而,即使同一刺激筆者也可以看到不同的Ca2+信號。雖然在某些氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ABA不能誘導(dǎo)鈣信號的產(chǎn)生,但是這些細(xì)胞并不是終生不會產(chǎn)生,它們將最終“學(xué)會”使用鈣信號,并“記住”如何對付外界的環(huán)境變化,產(chǎn)生相應(yīng)的鈣信號,即在細(xì)胞發(fā)育過程中乃至成熟之后,細(xì)胞狀態(tài)總是隨著外界環(huán)境條件的改變,被迫進入新的、使用鈣信號的狀態(tài),以提供充足的信息,激發(fā)氣孔關(guān)閉。3.2[ca2+]cyt變化情況Ca2+信號可以直接由胞外鈣離子內(nèi)流產(chǎn)生,也可由胞內(nèi)鈣庫釋放產(chǎn)生,還可以兩方面共同作用形成Ca2+信號。目前研究中,探索[Ca2+]cyt升高的Ca2+來源問題,人們大多選用藥理學(xué)試驗。目前試驗中花粉管(Franklin-Tong)的生長,缺氧、冷擊過程中的胞質(zhì)Ca2+變化主要是胞內(nèi)Ca2+庫的Ca2+釋放。而在目前為止的植物防衛(wèi)反應(yīng)中,所有的試驗結(jié)果則都表明胞外鈣離子發(fā)揮了重要作用。比如,大豆、胡蘿卜和煙草中,胞外鈣離子的降低,使植保素合成受到部分抑制。而在冷刺激、干旱、缺氧和鹽脅迫的條件下誘發(fā)的[Ca2+]cyt的升高,主要來源是胞外鈣離子內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫鈣離子的釋放共同作用造成的?，F(xiàn)在由于膜片鉗技術(shù)的發(fā)展,人們可以更直接的檢測質(zhì)膜鈣通道的電流特征,更深入的研究鈣信號產(chǎn)生、調(diào)控[15~17]。本文試驗結(jié)果表明,當(dāng)用50μmol·L-1ABA處理玉米下表皮保衛(wèi)細(xì)胞時,可誘導(dǎo)大多數(shù)保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt升高。異搏啶預(yù)處理30min后,ABA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt升高仍能發(fā)生,與未用異搏啶處理過的ABA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt相比,[Ca2+]cyt的變化形式未變,但升高幅度卻有降低。對此存在兩種可能性:ABA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt升高,Ca2+可能來源于胞內(nèi)鈣庫的Ca2+釋放,或質(zhì)膜鈣通道對異搏啶不敏感,因而異搏啶不能完全抑制胞外Ca2+的內(nèi)流。對此又以2mmol·L-1EGTA預(yù)處理玉米表皮條30min進一步試驗,結(jié)果顯示,EGTA抑制了ABA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt升高,這暗示ABA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt升高可能主要是胞外鈣離子內(nèi)流造成的,同時也間接說明質(zhì)膜鈣通道對異搏啶不敏感,因而還需進一步研究(其它鈣通道試劑或膜片鉗技術(shù)),但本文的試驗結(jié)果可以初步斷定:50μmol·L-1BA誘導(dǎo)的[Ca2+]cyt升高主要源于胞外鈣離子的內(nèi)流。這雖與Wood的報道結(jié)果不同,但由于[Ca2+]cyt產(chǎn)生的復(fù)雜性,也許ABA濃度的不同或者試驗材料的不同都會造成保衛(wèi)細(xì)胞[Ca2+]cyt變化時鈣離子來源和動態(tài)變化的不同