型登革病毒在kmb17上的適應性培養(yǎng)及增殖動態(tài)研究

型登革病毒在kmb17上的適應性培養(yǎng)及增殖動態(tài)研究

病毒位于真菌病毒科，屬于黃毒科黃色病毒科。它主要通過埃及蚊和白紋蚊傳播，導致真菌病毒（df）、發(fā)病率高、死亡率高的登甲出血熱（dhf），以及登甲休克綜合征（sds）。病毒在蚊體內以及白紋伊蚊傳代細胞(C6/36細胞)、猴腎、地鼠腎原代和傳代細胞中能增殖,并產生明顯的細胞病變。病人及隱性感染者是本病的主要傳染源,而叢林中的靈長類是維護病毒在自然界循環(huán)的動物宿主。迄今為止全球仍沒有獲準上市的登革病毒疫苗,目前最有潛力的傳統(tǒng)減毒活疫苗候選株是由泰國沃特瑞德研究所(WRAIR)研發(fā)的以犬腎細胞和恒河猴胚肺細胞為基質的疫苗,Vero細胞也被認為是疫苗開發(fā)的候選基質,以人源性細胞制備的登革疫苗候選株還未見報道。因此研究登革病毒在人源性細胞上的適應性對于登革病毒疫苗的研發(fā)具有重要意義。人胚肺二倍體細胞株KMB17由醫(yī)學生物學研究所建立并擁有自主知識產權,作為人源性細胞基質生產人用疫苗時,引入的外源因子較少,比動物來源的細胞基質具有更好的安全性,且能實現大規(guī)模疫苗生產,已經成功應用于甲肝疫苗、脊髓灰質炎疫苗的生產。本研究將Ⅲ型登革病毒中國株D9964在人胚肺二倍體細胞KMB17上培養(yǎng)適應,并對其生物學特性和增殖動力學進行研究,成功篩選并純化出能在KMB17細胞中穩(wěn)定增殖并具有良好抗原性的適應株。此研究將打破登革病毒宿主細胞局限性,為登革病毒疫苗的研發(fā)開拓新的思路,為研發(fā)我國擁有自主知識產權的登革病毒滅活疫苗及減毒活疫苗奠定基礎。材料和方法1東省疾病預防控制中心Ⅲ型登革病毒中國株D9964為廣東省疾病預防控制中心惠贈,KMB17細胞(第21代)由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所分子流行病室保存。2抗血清、igg和型登革病毒人源MEM培養(yǎng)基由該所生物制品四室提供;新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;Ⅲ型登革病毒人源抗血清購自英國國家生物制品檢定所(NIBSC);FITC標記的兔抗人IgG購自Sigma公司;病毒RNA/DNA抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司;RealTime-PCR試劑盒購自大連寶生物公司。3方法3.1rt-pcr擴增根據衛(wèi)生部發(fā)行的《登革熱診斷標準》中所述的“RT-PCR技術檢測登革病毒RNA及型別鑒定”方法,合成登革病毒通用引物(D1和D2)和Ⅲ型登革病毒型特異性引物(D1和TS4)。以收獲10代的病毒培養(yǎng)物基因組RNA為模板,通過RT-PCR對Ⅲ型登革病毒特異性基因進行擴增,擴增片段大小分別為511bp和393bp。引物序列D1:5′-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3′,D2:5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′TS3:5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′。反應條件:50℃30min合成cDNA;94℃預變性2min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,共35個循環(huán);最后72℃延伸7min。3.2細胞增殖檢測以100μlⅢ型登革病毒中國株D9964接種長至單層、生長狀態(tài)良好的C6/36細胞,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7~10d,待細胞病變達++++,收集細胞液,于4℃,3000r/min離心5min后收獲上清,-70℃保存。采用微量滴定法測定病毒滴度,將vero細胞按104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板,待細胞長成致密單層后,將病毒用含2%血清MEM培養(yǎng)基以10倍系列稀釋,每個稀釋度設4個復孔,每孔加入100μl,并設細胞對照和未稀釋病毒對照。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7d,記錄細胞病變程度。按Reed-Muench公式計算病毒的感染性滴度。3.3細胞培養(yǎng)和增殖將-70℃保存的登革病毒于37℃水浴5min,用PBS將已鋪滿單層,生長狀態(tài)良好的KMB17細胞洗滌1次,以4.0MOI的毒種進行適應性傳代,加入含2%血清的MEM維持液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)7d,鏡下觀察細胞病變(CPE)。培養(yǎng)7d后收毒,反復凍融2次,再以同樣方法接種下一代,直至細胞出現病變,CPE達++++,篩選出的能夠在KMB17細胞上增殖的毒株檢測滴度并于-70℃保存。將篩選出的登革病毒以4.0MOI接種長至單層、狀態(tài)良好的KMB17細胞,在5%血清濃度的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)傳10代。采用微量滴定法測定每代病毒液感染性滴度。3.4細胞培養(yǎng)和病毒的分離培養(yǎng)利用KMB17細胞對選育出的Ⅲ型登革病毒D9964細胞適應株進行噬斑篩選純化。棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細胞的培養(yǎng)液,用Hanks液漂洗2次。用不含血清的維持液將病毒稀釋后以4.0MOI接種細胞,置37℃孵育4h,每隔15min輕輕水平晃動培養(yǎng)板數次,以保證病毒與細胞充分接觸。吸附完畢吸出病毒液,加1ml含0.1%中性紅,5%胎牛血清的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基,倒置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2d之后每天觀察2次,記錄蝕斑出現和生長情況,直至大小適宜時吸取斑點,以維持液稀釋后接種96孔板,收集病變孔的培養(yǎng)液,以上述方法進行3輪蝕斑純化。3.5實驗細胞的擴增用免疫熒光法檢測病毒抗原性。以KMB17細胞接種放有玻片的6孔板,長至單層后各2孔細胞以4.0MOI接種登革病毒原液和KMB17細胞第10代適應株,2孔作對照,用含5%血清MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72h,取出孔里的玻片進行熒光染色。一抗為Ⅲ型登革病毒抗血清,二抗為FITC標記的羊抗人IgG。3.6病毒適應株在細胞中的增殖動態(tài)將病毒純化株接種KMB17細胞,以第3~7d細胞培養(yǎng)上清液提取RNA為模板,通過Real-timePCR檢測病毒適應株在細胞中的增殖動態(tài)。引物為:FP:5′-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3′,RP:5′-GGCGTTCTGTGCCTGGAAT-3′.反應條件:45℃5min合成cDNA;94℃預變性2min;94℃30s,60℃30s,共40個循環(huán);最后72℃延伸7min。結果1rt-pcr擴增以獲得的登革病毒基因組RNA為模板,通過RT-PCR對Ⅲ型登革病毒特異性基因進行擴增,獲得511bp的登革病毒特異性條帶和290bp的Ⅲ型登革病毒型特異性條帶。2病毒登格病毒的擴散和滴注量的測定以C6/36細胞擴增收獲200mlⅢ型登革病毒,微量滴定法測定病毒感染性滴度為3.50CCID50/mL。3鄧氏病毒適用于kb-17細胞的培養(yǎng)登革病毒接種KMB17細胞傳至第3代時第7d細胞出現病變,到第12d達+++,證明登革病毒已適應在KMB-17細胞內復制。4病毒感染情況檢測結果顯示,D9964株在KMB17細胞上連續(xù)傳代10代,病毒滴度呈持續(xù)升高直至穩(wěn)定的適應過程,傳第1和第2代最低,細胞無明顯病變,傳至第3代時,細胞開始有明顯病變,病毒的感染滴度達到2.25CCID50/mL,至第9和第10代滴度最高,達到5.5CCID50/mL。5養(yǎng)基純化期斑登革病毒在含中性紅的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng),3輪噬斑純化均在3d后出現微小斑點,至5~6d斑點直徑長至約0.8~1mm,此時大小適宜接種。6免疫熒光登革病毒D9964株在KMB17細胞上傳代10代后,以Ⅲ型登革病毒抗血清進行免疫熒光染色。結果顯示,在接種病毒的細胞內可見明亮的綠色熒光,而對照組細胞內未見綠色熒光,表明選育出的適應株在KMB17細胞中可以增殖并具有良好的抗原性。7不同培養(yǎng)條件對病毒增殖的影響以第3~7d病毒培養(yǎng)物提取RNA為模板檢測D9964病毒純化株在細胞中的增殖動態(tài),Real-timePCR結果顯示樣品擴增的Ct值隨病毒培養(yǎng)時間推移逐漸減小,由于Ct值與初始模板量成反比,因而由擴增曲線可看出病毒接種KMB17細胞后第3d已經開始增殖,在第5~6d增殖最為迅速,在第7d病毒增殖達到最高峰。人源性二倍體細胞的基因文化和免疫部分近年來,由于全球氣候變暖、人口流動頻繁等因素,登革熱在全世界的發(fā)病率提高了近30倍。在過去兩年中全球登革熱感染人群的數量持續(xù)增長,在東南亞中部和南部地區(qū)、美國以及南太平洋地區(qū),每年約8000萬人感染登革病毒,估計有24000人死亡,超過100個國家的30億人受到威脅,已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。迄今為止全球仍沒有獲準上市的登革病毒疫苗,因此登革疫苗研發(fā)迫在眉睫。在研疫苗中采用的細胞基質大多為動物源性細胞,包括Vero、PDK、PGMK和FrhL等,這些傳代細胞作為培養(yǎng)基質所生產的疫苗產品理論上有致腫瘤的危險,以人源性細胞制備的登革疫苗候選株還未見報道。WHO認為疫苗的生產應首先考慮采用人源性二倍體細胞或已知特性的傳代細胞,并應嚴格控制外源因子的污染。KMB-17二倍體細胞株源于人胚肺組織,對至少71種病毒敏感,且與上述傳代細胞相比,在理論上不存在致腫瘤的危險性。此外,初次感染其中一種型別的登革熱病毒后,機體會產生針對此型病毒的特異性抗體,如再次感染異型病毒,病毒抗原與抗體形成免疫復合物,與單核/巨噬細胞表面的Fc受體或補體結合,在這些細胞中大量復制并且毒力增強,出現抗體依賴性感染增強作用(ADE),導致血管通透性增加、血漿外滲、血容量減少,血液濃縮和休克等一系列病理變化,這給登革熱病毒的疫苗研究帶來了很大的挑戰(zhàn)和困難。因此理想的登革疫苗需是四價的,要求能誘導同時針對4個血清型登革病毒的均衡的免疫應答,且免疫應答水平應足夠高。在前期研究中我們已成功篩選出Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型登革病毒的KMB17細胞適應株,本實驗選育出的Ⅲ型登革病毒D9964KMB17細胞適應株將為研究四價疫苗奠定基礎。下一步將繼續(xù)針對KMB17細胞擴增的四種型別登革病毒配比和佐劑的選擇進行探索,制備滅活疫苗候選株,同時通過一系列體外實驗和動物實驗對其免疫原性以及是否引起抗體依賴的增強作用(ADE)進行評價,確保候選疫苗能夠產生針對四種血清型登革病毒(