幾種血清學(xué)方法檢測登革病毒的結(jié)果比較

幾種血清學(xué)方法檢測登革病毒的結(jié)果比較

病毒登格病毒是一種重要的昆蟲傳播疾病，主要通過白臉蚊和埃及蚊子感染和傳播。它的基因是一個(gè)完整的rap，由一個(gè)獨(dú)特的開放讀碼框架編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（c、prm和e）和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5）。自然界中存在4種血清型登革病毒,每種血清型感染均可導(dǎo)致登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合征,目前廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū),對人類健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重要威脅。大多數(shù)登革熱病例的診斷可依據(jù)流行病學(xué)資料和臨床表現(xiàn),對于非典型或疑似病例,則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室診斷才可確診。同時(shí),登革熱的臨床表現(xiàn)復(fù)雜,多數(shù)癥狀非該病特有,與基孔肯亞熱等病毒性出血熱癥狀難以區(qū)分,必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行鑒別診斷。此外,登革出血熱的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,異型登革病毒的二次感染可導(dǎo)致抗體依賴性感染增強(qiáng)(ADE),因此區(qū)分初次感染和二次感染具有重要的臨床意義。登革熱的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù),除經(jīng)典的病毒分離外,主要針對不同標(biāo)本中登革病毒特異的抗原、抗體或核酸進(jìn)行檢測,主要包括血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。這些診斷方法各具特色,相互補(bǔ)充,臨床病例的最終確診往往需要綜合考慮多種方法的檢測結(jié)果。1血藥濃度和感染期ns1抗體的變化登革病毒感染可以分為兩個(gè)階段,第一階段:發(fā)熱和病毒血癥期,血液中可檢測到病毒和NS1抗原;第二階段:發(fā)熱期過后,體內(nèi)產(chǎn)生大量的IgG和IgM抗體。患者初次感染登革病毒時(shí),病毒血癥一般與發(fā)熱同步,IgM抗體的出現(xiàn)一般在發(fā)病5d后,而IgG抗體一般于發(fā)病10~15d后出現(xiàn),并將長期存在。二次感染時(shí),病毒血癥期可持續(xù)2~3d,血液中NS1抗原存在的時(shí)間可以更長,IgM抗體迅速出現(xiàn),但滴度遠(yuǎn)低于初次感染,而IgG抗體滴度將迅速升高。通常,病毒血癥結(jié)束前或退熱前無法檢測到IgM抗體的產(chǎn)生。對登革熱患者而言,由于突然發(fā)熱和身體不適,患者一般在發(fā)熱頭2d就去醫(yī)院就診。在本階段,診斷方法只能夠檢測病毒、RNA或血液中的NS1抗原。血清學(xué)診斷方法只有在退熱期才會出現(xiàn)陽性,因此急性期和恢復(fù)期的雙份血清的診斷結(jié)果具有重要的臨床意義。2在一般意義上的應(yīng)用病毒分離培養(yǎng)是檢測登革病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn),能夠?qū)毙云跇颖具M(jìn)行確認(rèn),并能夠區(qū)分血清型。但是該方法耗時(shí)長,一般需要5~10d,需要專業(yè)人員和設(shè)備,對樣本儲存和運(yùn)輸要求條件高,因此,在普通實(shí)驗(yàn)室很難被推廣和應(yīng)用。登革病毒的分離培養(yǎng)可通過活蚊、細(xì)胞或動物進(jìn)行?；钗?巨蚊和伊蚊)分離是目前最敏感的登革病毒分離方法,但對接種技術(shù)要求高。蚊蟲細(xì)胞(C6/36、AP-61或TRA-284)分離具有較高的敏感性。此外,也可利用哺乳動物細(xì)胞(BHK21、LLC-MK2)或乳鼠顱內(nèi)接種作為登革病毒的分離培養(yǎng)方法。分離培養(yǎng)物可進(jìn)一步利用間接免疫熒光法、RT-PCR或流式細(xì)胞術(shù)來檢測登革病毒的存在。3實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)rt-pcr檢測與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法相比,核酸檢測技術(shù)更為快速和敏感。登革病毒的核酸檢測主要通過RT-PCR及其衍生的相關(guān)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。核酸檢測技術(shù)能夠特異擴(kuò)增病毒基因組RNA,并能夠區(qū)分血清型,反應(yīng)時(shí)間短,適合急性期標(biāo)本的檢測,具有確診意義。目前,RT-PCR相關(guān)技術(shù)種類繁多,各具優(yōu)勢,而且其發(fā)展已逐步趨向簡化操作,包括從多對引物到一對通用引物、兩步法到一步法、多管反應(yīng)到單管反應(yīng)等。目前,一般采用登革病毒的通用引物,同時(shí)檢測4個(gè)血清型的登革病毒,然后再進(jìn)一步鑒定不同的血清型。通用引物分別位于登革病毒的E、NS1、NS3基因或3′-UTR上。Harris等建立了單管多重RT-PCR法,能夠在同一反應(yīng)管中對4個(gè)血清型登革病毒RNA分別擴(kuò)增獲得不同長度的片段,進(jìn)一步簡化了操作程序,并提高了檢測的敏感性和特異性。實(shí)時(shí)定量RT-PCR具有反應(yīng)時(shí)間短、污染率低、敏感性及特異性強(qiáng)、自動化程度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),已逐步取代常規(guī)RT-PCR用于患者急性期診斷。很多實(shí)驗(yàn)室已針對登革病毒基因組的不同區(qū)域,建立了型特異的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測方法。單管中進(jìn)行多達(dá)4種熒光基團(tuán)標(biāo)記的多重實(shí)時(shí)PCR法也有報(bào)道。此外,一些新型病毒核酸檢測技術(shù)也被用于登革病毒核酸的檢測。2001年,Wu等建立了可用于從臨床標(biāo)本中檢測登革病毒RNA的核酸序列等溫?cái)U(kuò)增法(NASBA),發(fā)現(xiàn)此方法的敏感性與C6/36細(xì)胞分離病毒方法相當(dāng),檢出率達(dá)98.5%,相對特異性達(dá)到了100%,較ELISA方法更敏感和特異。2005年,Parida等將環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增方法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)應(yīng)用于登革病毒的臨床標(biāo)本檢測中,可在30min內(nèi)對登革病毒血清型做出鑒定,其敏感性高于病毒分離培養(yǎng)法和常規(guī)的RT-PCR方法。LAMP技術(shù)的優(yōu)勢在于特異性強(qiáng),反應(yīng)時(shí)間短,敏感性高,設(shè)備簡單,成本低廉,結(jié)果易判斷,非常適合在發(fā)展中國家推廣使用。此外,Baeumner等將PCR技術(shù)與核酸雜交技術(shù)相結(jié)合,建立了用于登革病毒檢測的生物傳感器方法,能夠在15min內(nèi)獲得檢測結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,又發(fā)展出多分析物單膜生物傳感器和微液流熒光檢測生物傳感器,可對登革血清型進(jìn)行鑒定。盡管基于核酸的檢測技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用,但是尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和試劑,考慮到核酸擴(kuò)增反應(yīng)的特殊性,必須制定嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分區(qū)操作指南,避免實(shí)驗(yàn)室污染和假陽性的出現(xiàn)。4急性期定位檢測NS1蛋白是登革病毒感染的主要標(biāo)志性抗原,NS1蛋白出現(xiàn)時(shí)間早于IgM抗體,甚至在檢測不到登革病毒RNA的情況下,也可檢測到NS1蛋白。但在二次感染患者體內(nèi)存在抗原抗體復(fù)合物,降低了抗原檢測方法的敏感性。最近Shu等報(bào)道,運(yùn)用ELISA和斑點(diǎn)印跡法,在初次和二次感染的患者急性期血清中可檢測到高濃度的以免疫復(fù)合物形式存在的NS1抗原。目前,已有多個(gè)商品化試劑盒用于檢測登革病毒的NS1抗原。Kumarasamy等對Bio-Rad公司的ELISA試劑盒與病毒分離和RT-PCR方法進(jìn)行了比較,敏感性高達(dá)93.4%,特異性為100%。PanBio研發(fā)的NS1特異抗體捕獲ELISA試劑盒可識別登革1~4型病毒NS1的交叉抗原結(jié)合位點(diǎn),該方法雖然可檢測不同血清型的登革病毒,但研究發(fā)現(xiàn),該試劑盒對登革1型病毒感染的陽性血清檢出率較高,而對登革4型的檢出率較低。我國Ding等建立的基于型特異性單抗的NS1抗原捕獲ELISA,與PanBio試劑相比,其敏感性更高。5關(guān)于igg抗體在無法采用病毒分離及抗原檢測等直接診斷方法時(shí),用血清學(xué)方法檢測登革病毒感染是一個(gè)很好的選擇。由于登革感染患者的體液免疫反應(yīng)在發(fā)病后至少可持續(xù)數(shù)周,因此標(biāo)本的采集時(shí)間比較靈活。而且免疫球蛋白較穩(wěn)定,不易被滅活,因此,對于長期暴露在較高溫度下的標(biāo)本,更適用于血清學(xué)檢測。下面著重闡述IgM/IgG抗體檢測方法。大多數(shù)登革患者發(fā)病3~5d后即可檢測到特異IgM抗體的產(chǎn)生。一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),93%的患者可在發(fā)病6~10d內(nèi)檢測到IgM抗體,99%的患者可在發(fā)病后10~20d內(nèi)檢測到IgM抗體。同時(shí),IgM抗體可能存在3個(gè)月甚至更長時(shí)間,單純IgM抗體陽性有時(shí)無法判斷近期感染,一般需要雙份血清進(jìn)行確診。目前已有檢測IgM抗體的商業(yè)化ELISA試劑盒和免疫層析(膠體金)試紙條,但其敏感性與特異性差異受抗原影響較大。研究人員對4種IgMELISA試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),其敏感性在21%~99%之間,特異性在77%~98%之間。部分瘧疾患者和早期登革熱感染者會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。ELISA試劑盒敏感性相對較高,一般需要60~90min獲得結(jié)果;而膠體金試紙條反應(yīng)時(shí)間短(15~30min),更適用于現(xiàn)場調(diào)查。此外,間接免疫熒光法檢測IgM抗體在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用,但需要專業(yè)人員操作和判斷,尚無商品化試劑盒問世。初次感染IgG抗體產(chǎn)生一般較IgM抗體晚,并能夠終生存在。急性期和恢復(fù)期雙份血清IgG抗體4倍升高具有確診意義。基于IgG抗體的ELISA試劑盒已有較多,盡管其敏感性高于血凝抑制試驗(yàn),但其特異性同樣存在較大變異。此外,IgG/IgM抗體比率常用于區(qū)分初次和二次感染。Innis等使用IgM和IgG捕獲ELISA法檢測登革IgM和IgG抗體,當(dāng)IgM/IgG比值>1.8時(shí),為初次感染;當(dāng)IgM/IgG比值<1.8時(shí),為二次感染。當(dāng)無IgM時(shí),IgG4倍升高為二次感染。Kuno等采用IgM捕獲法和間接ELISA法測定登革IgM和IgG抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)IgM/IgG比值>1.4時(shí),為初次感染;當(dāng)IgM/IgG比值<1.4時(shí),為二次感染。PanBio公司開發(fā)的IgM&IgG聯(lián)檢ELISA試劑盒亦可區(qū)分初次感染和二次感染。但是,目前采用捕獲IgM/IgG比值法鑒別初次和二次感染尚無一致的標(biāo)準(zhǔn),