乙腦病毒prme基因的克隆及表達

乙腦病毒prme基因的克隆及表達

病毒登甲病毒（dv）是黃毒科黃毒科重要成員。它分為四種類型。它可以通過蚊子傳播，引起人的革蘭氏熱。癥狀包括高燒、頭痛、肌肉疼痛、關節(jié)和皮疹。據WHO估計,全球有25~30億人口面臨登革病毒感染危險,每年有大約5千萬至1億登革熱(Denguefever,DF)病例出現,其中50萬病例發(fā)展成嚴重形式的登革熱,即登革出血熱(Denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(Dengueshocksyndrome,DSS),全球每年因登革病毒感染死亡的人數是2.5萬。但是目前尚無有效預防DV感染的疫苗。由此,登革病毒疫苗也一直是各國學者的研究焦點之一。近60年來,登革疫苗研制工作持續(xù)進行,目前,已經存在關于登革疫苗的多個報道,其中報道的登革疫苗形式包括滅活疫苗、減毒疫苗、重組亞單位疫苗、核酸疫苗、腺病毒載體疫苗。近年來以弱毒黃病毒為基因骨架構建嵌合病毒成為研究登革病毒疫苗的一個新思路。乙腦病毒(Japaneseencephalitsvirus,JEV)SA14-14-2株是我國自行研制的減毒活疫苗。本論文作者所在研究組已成功構建乙腦病毒疫苗株SA14-14-2的復制子并證實該復制子具有自主復制能力和表達外源蛋白的能力。本研究在此基礎上構建了感染性乙腦/登革2型嵌合體克隆,拯救得到乙腦/登革2型嵌合病毒并且對其鑒定,研究結果現報告如下。材料和方法1試劑與檢測方法DV2(NGC株)由本研究室保存;JEVSA14-14-2株復制子載體pPartial△prM/E由本室構建;BHK-21細胞、C6/36細胞為本研究室保存;TRIzolReagent、SuperScriptIII第一鏈合成試劑盒、PlatinumPfxDNA聚合酶為Invitrogen公司產品;限制性內切酶、T4DNA連接酶系Biolab公司產品;DNA純化試劑盒是QIAGEN公司產品;質粒提取試劑盒為Omega公司產品;體外轉錄試劑盒RIBOMAXlargescaleRNAproductionsystem及Ribom7GcapAnalog為Promega公司產品;DV2重組EⅢ蛋白免疫的兔血清由本室制備;FITC標記抗兔IgG抗體,HRP酶標抗兔IgG抗體為Sigma公司產品。引物合成由上海生工生物工程公司完成。2dv2prm/e基因的擴增與純化我們在構建JEV復制子時,刪除prM/E基因并同時保留E蛋白羧基端的71個氨基酸(213bp)。因此,本試驗中擴增DV2prM/E基因時,截去了3′端的213bp。DV2的prM/E基因以DV2病毒全長基因組cDNA為模板,使用PlatinumPfxDNA聚合酶,用以下引物進行PCR擴增:上游引物5′-accggtTTCCATTTAACCACA-3′(小寫字符部分為引入的AgeI限制性酶切位點);下游引物5′-cccgggGGATCCAAAATCCCAAGCTG-3′(小寫字符部分為引入的XmaI限制性酶切位點),擴增條件為:94℃預變性30s,94℃15s,52℃30s,68℃2min,共25個循環(huán),68℃延伸10min,4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化和回收。回收產物加A尾后連接至T載體。目的TA克隆經酶切鑒定及測序正確后備用(測序工作由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成)。含DV2prM/E基因的目的TA克隆經AgeI和XmaI雙酶切處理,回收目的片段。回收的目的片段與經相同酶消化的pPartial△prM/E定向連接,連接產物轉化大腸桿菌XL1-Blue。陽性質粒通過小量制備法制備并經酶切法進一步鑒定,獲得的重組質粒命名為pJEE-1770。3體外轉錄nd-pcr反應體系質粒pJEE-1770經SalI線性化并純化后,利用Promega的RIBOMAXlargescaleRNAproductionsystem在組成如下的100μl反應體系中體外轉錄成RNA:5×轉錄緩沖液20μl、rNTPs30μl(rATP25mmol/L、rCTP25mmol/L、rUTP25mmol/L、rGTP8.33mmol/L)、m7Gcap5μl、酶混合物(T7)10μl、線性化pJEE-1770質粒35μl(15~25ng/μL)。反應體系在37℃孵育4h后,加入2μlDNA酶并在37℃孵育20min,以消除模板DNA。體外轉錄物用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit純化,定量、分裝并保存在-70℃。4細胞電穿孔轉染將1只T25方瓶中貼壁長滿的BHK-21細胞用10%胰酶消化法處理,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞,以400g離心5min;用無菌冷PBS洗細胞2次,將細胞重懸于400μlPBS中,加入10μg前述體外轉錄的RNA并充分混勻后,立即在BioradGenePulser中以電穿孔法轉染。電穿孔轉染的參數是:電壓850v、電容25μF、電阻∞、脈沖兩次。電擊后的細胞置于冰上5min,立即轉移至預先加入2.5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液的六孔板中,在37℃培養(yǎng),待細胞貼壁后更換細胞培養(yǎng)液一次。按照相同方式處理的正常BHK-21細胞為陰性對照。逐日觀察細胞形態(tài)。5分離人細胞及細胞形態(tài)觀察轉染的BHK-21細胞出現CPE后,將該細胞連同培養(yǎng)液反復凍融3次,4000rpm離心10min。取0.5ml上清液分別接種在T25方瓶中傳代的BHK-21細胞及C6/36,分別在37℃和28℃吸附1h后,加入含1%FBS的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),并逐日觀察細胞形態(tài)。獲得的嵌合病毒命名為JED21770V。6基于生物酶活性的cdnapcr檢測從接種JED21770V并出現CPE的C6/36細胞培養(yǎng)物中提取總RNA并將其反轉錄為cDNA。以此cDNA為模板,用以下引物:Pf5′-CGAGAACTTGGAACACTCATTGACG-3′Pr5′-GCGCTTTGTGGACGATCTTCGCTAG-3′實施PCR擴增。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收、純化并送測序。7制備產物葉片將接種JED21770V并出現CPE的C6/36細胞經胰酶消化法處理后,以機械方式吹下,用PBS洗滌2遍。細胞重懸于PBS中,制備抗原片,用丙酮固定15min。抗原片以DV2重組EⅢ蛋白(E蛋白的第三結構域)免疫的兔血清為第一抗體(用PBS稀釋至1:200),FITC標記羊抗兔血清為第二抗體(1:100)按常規(guī)間接免疫熒光操作步驟處理后在熒光顯微鏡下觀察。8sds-東南角電泳將細胞裂解液(50mmol/LTris·Cl,150mmol/LNaCl,0.1%SDS,100μg/mLPMSF,1μg/mLAprotintin,1%NP-40,0.5%去氧膽酸鈉)添加至接種JED21770V并出現CPE的細胞,隨后在冰上放置30min。取40μl裂解混合物與10μl5×上樣緩沖液混合,煮沸3min,在12000r/min離心10min。所得上清液進行SDS電泳,隨后將電泳后凝膠中的蛋白質經半干式電轉移法轉移至PDVF膜上。以DV2重組EⅢ蛋白免疫的兔血清為第一抗體(1:200),HRP標記羊抗兔血清為第二抗體(1:2000),DAB為顯色底物,對前述PDVF膜實施常規(guī)Westernblot檢測。結果1目的片段的核苷酸測序結果以DV2病毒cDNA第一鏈為模板,用PCR擴增prM/E基因,得到大小1770bp的目的擴增片段。測序結果顯示,所得目的片段的核苷酸序列與DV2NGC株的核苷酸序列完全一致,同源性為100%(結果未顯示)。含prM/E基因的TA克隆質粒經前述雙酶切處理,回收的目的片段克隆至質粒pPartial△prM/E。所得的重組質粒pJEE-1770經酶切鑒定符合預期(結果未顯示)。2brk-21細胞上原因的檢測pJEE-1770的體外轉錄物轉染BHK-21細胞后5~7d可觀察到典型CPE,即細胞變圓、脫落,與DV2及JEV在BHK-21細胞上引起的CPE相似(圖1)。將收集的第一代病毒在BHK-21細胞中連續(xù)傳代,結果盲傳5代均不能檢測到病毒。而在C6/36細胞中培養(yǎng)的嵌合病毒JED21770V可使細胞在感染4d左右出現典型病變,表現為細胞的腫脹和聚集,與DV2及JEV在C6/36細胞上引起的CPE相似,但是對該細胞的聚集效應在程度上不及親本毒株DV2及JEV(見圖2)。3pcr檢測dv2prm/e、jevc及ns1的表達從接種第二代JED21770V并出現CPE的C6/36細胞中提總RNA并反轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板,用針對嵌合病毒prM/E基因兩個側翼區(qū)所設計的引物實施PCR擴增,結果獲得大小約2100bp的擴增片段,與預期一致。以體外轉錄獲得的轉染前RNA為陰性對照,結果未擴出預期片段,表明DNA模板已消化完全。將擴增的片段測序,測序結果經比對后,表明該擴增片段是DV2prM/E與JEVC及NS1的嵌合基因。我們在構建嵌合體克隆時,為便于克隆外源基因,在prM/E基因兩側引入了AgeI及XmaI兩個酶切位點,測序時均測到這兩個遺傳標記(結果未顯示)。4蛋白免疫因子檢測以第三代嵌合病毒感染的C6/36細胞制備抗原片,以DV2重組EⅢ蛋白(E蛋白第三結構域,含多個抗原表位)兔免疫血清為第一抗體,可檢測到特異性熒光,說明登革病毒的E蛋白表達。JEV感染的C6/36細胞及正常C6/36細胞均不與這種抗血清反應。間接免疫熒光鑒定結果見圖3。5dv2抗體的制備嵌合病毒JED21770V感染的C6/36細胞裂解液以Westernblot進行鑒定,其中以DV2重組EⅢ蛋白免疫的兔血清為第一抗體,DV2感染的C6/36細胞裂解液為陽性對照。鑒定表明,在60kD分子量標記處均可見到預期條帶。Westernblot鑒定結果見圖4。以den4為分子的嵌合病毒的誘導表達乙腦病毒與登革病毒同為黃病毒科黃病毒屬成員,是單股正鏈RNA病毒,基因組長約11kb,含單一開放讀碼框。黃病毒科成員的基因結構較保守,其基因組中編碼區(qū)及非編碼區(qū)(NCR)的排列順序為5′NCR-C-PrM/M-E-NS1-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3′),其中E基因編碼的E蛋白是病毒的表面包膜糖蛋白,具有結合靶細胞表面受體\介導膜融合、誘導中和抗體產生等重要生物學功能,是病毒的最重要的抗原成份。PrM基因編碼的PrM/M蛋白也認為是誘導中和抗體產生的抗原成分。非結構基因及非編碼區(qū)主要與病毒復制及病毒蛋白質翻譯有關。1991年,Bray以DEN4814669cDNA克隆為骨架,用DEN1WP株的結構蛋白基因C-prM-E和DEN2NGC株的prM/E置換DEN4的相應基因后獲得表達DEN1和DEN2結構蛋白的嵌合病毒,開辟了黃病毒嵌合病毒研究的新領域。目前有關黃病毒嵌合病毒的研究多以弱毒株作為基因骨架,將弱毒株的結構蛋白基因替換為目的基因,從而獲得表達目的基因與結構蛋白的嵌合體。嵌合體以活病毒的形式遞呈保護性抗原,可誘導較強的體液免疫和細胞免疫。目前使用較成功的載體系統(tǒng)是黃熱病毒減毒株YF-17D及登革病毒減毒株DEN2PDK-53。以YF-17D為載體構建的DV1~4型嵌合體病毒具有毒力弱、免疫原性強的特點,并且將很快進入Ⅲ期臨床試驗評價。我們在前期研究中,構建了JEVSA14-14-2株的感染性克隆,并在此基礎上刪除結構蛋白prM/E基因,從而構建了便于外源基因克隆的JEV復制子。本研究在上述工作的基礎上,在JEV復制子中插入DV2的prM/E基因,并在BHK-21細胞中成功拯救出乙腦/登革2型嵌合病毒。拯救的嵌合病毒經RT-PCR、IFA、Westernblot等方法鑒定后證實具有嵌合核酸,并且能夠表達DV2的包膜蛋白。本研究的嵌合病毒可以在C6/36細胞中連續(xù)傳代,并且可以使C6/36細胞產生與親本毒株類似的腫脹、聚集等病變效應。但是將拯救的第一代嵌合病毒在BHK-21細胞中盲傳5代,每代都不能檢測到病毒,這說明盡管嵌合病毒可以在BHK-