內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療糖尿病兔下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究

內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療糖尿病兔下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究

內(nèi)陸祖細(xì)胞（epc）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前細(xì)胞。在胚胎發(fā)育之前，通過克隆和分離，血漿島外的epc發(fā)育并形成最原始的血管結(jié)構(gòu)。這個(gè)過程被稱為血管疾病。過去認(rèn)為,血管發(fā)生僅存在于胚胎時(shí)期,近年來越來越多的證據(jù)表明,在成年個(gè)體中也有少量的EPC,主要存在于骨髓和外周血中。目前開展的骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的研究正是利用骨髓中的EPC形成新生血管的潛能,來促進(jìn)血管的恢復(fù)與形成。眾所周知,糖尿病患者中,缺血性疾病的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群,然而,該治療手段對(duì)于糖尿病患者是否有效尚不清楚。為了探討糖尿病動(dòng)物骨髓來源的EPC治療缺血性疾病是否有效進(jìn)行了本項(xiàng)研究。1對(duì)象和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、體重、體重、血糖2006年1月至9月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科選取健康日本大耳白兔30只(購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部),體重2～2.5kg,血糖≤7mmol/L。隨機(jī)分為3組,其中糖尿病磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組8只(A組)、糖尿病EPC移植治療組14只(包括Brdu標(biāo)記6只,B組)、正常血糖EPC移植治療組8只(C組)。1.2體重劑量設(shè)計(jì)及血糖檢測(cè)日本大耳白兔禁食24～48h后,臨時(shí)配制的3%四氧嘧啶(Sigma公司),按80mg/kg體重劑量由耳緣靜脈緩慢注射,30s內(nèi)注射完畢。72h后,血糖儀(羅康全,德國)檢測(cè)血糖,血糖≥16mmol/L建模成功。以后每周測(cè)定血糖1次,當(dāng)血糖<16mmol/L時(shí)按原劑量追加3%四氧嘧啶,直至血糖≥16mmol/L。本研究建模成功率為100%。1.3右后期皮膚注射采用股動(dòng)脈切除術(shù),對(duì)3組日本大耳白兔建立后肢缺血模型。日本大耳白兔經(jīng)1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后,固定于手術(shù)臺(tái)上。備皮、消毒后肢,無菌條件下,右后肢自腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)做一垂直縱行切口,沿股動(dòng)脈走行長軸切開皮膚,鈍性撥離出股動(dòng)脈全程,用絲線結(jié)扎髂外動(dòng)脈遠(yuǎn)端、股動(dòng)脈遠(yuǎn)端及股動(dòng)脈分支,然后切除股動(dòng)脈。術(shù)后以胰島素注射器(美國BD公司)在對(duì)照組右后肢局部注射20μLPBS;移植組右后肢局部注射含有2×106個(gè)EPC的20μLPBS。缺血局部共注射6個(gè)點(diǎn),最后逐層關(guān)閉切口,縫合皮膚。術(shù)后嚴(yán)密觀察,每天注射青霉素(8萬U/只),連續(xù)注射3d,預(yù)防傷口感染。1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染參見文獻(xiàn)、。所取動(dòng)物麻醉后,暴露左側(cè)脛骨,以含有肝素鹽水的注射器抽取脛骨骨髓5mL,加入到淋巴細(xì)胞分離液中,2000r/min,離心20min,分離單個(gè)核細(xì)胞后,轉(zhuǎn)入含PBS的10mL無菌離心管中,5倍體積的PBS洗滌3次,以每平方厘米接種5×106個(gè)EPC接種于培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)。使用M199誘導(dǎo)培養(yǎng)液[M199基本培養(yǎng)液,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)10ng·mL-1,堿性成纖維細(xì)胞生長因子b(FGF)2ng·mL-1],于37℃5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后首次換液,去除懸浮細(xì)胞。以后每3d換液1次。1.5荊豆凝集素fic-uea-i,acldl-dii,世界面為10gml的細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞與Dii標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-Dii,10μg·mL-1)37℃孵育24h后,加2%多聚甲醛固定細(xì)胞10min,用PBS浸洗,加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的荊豆凝集素(FITC-UEA-I,10μg·mL-1),37℃下孵育2h,多波長激光共聚焦顯微鏡下觀察,FITC-UEA-I和acLDL-Dii雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPC。1.6細(xì)胞培養(yǎng)brdu在培養(yǎng)液中加入5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine,Brdu,Sigma公司),濃度為30mmol/L,于細(xì)胞培養(yǎng)第7天換用加入Brdu培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后,細(xì)胞移植。取B組6只動(dòng)物接受標(biāo)記細(xì)胞的移植。1.7石蠟切片的制作B組接受Brdu標(biāo)記細(xì)胞的動(dòng)物,于術(shù)后第3,7,14天,收集接受Brdu標(biāo)記細(xì)胞移植的肌肉組織,制成石蠟切片。通過抗Brdu單克隆抗體(Sigma公司)免疫組化染色,監(jiān)測(cè)置入兔缺血后肢的EPC在體內(nèi)情況。1.8手術(shù)第14天測(cè)量以下指標(biāo)1.8.1免疫組化染色動(dòng)物肌肉制成橫切面石蠟切片后,抗Ⅷ因子相關(guān)抗原(1∶150,邁新公司)免疫組化染色。在光學(xué)顯微鏡下,每張切片隨機(jī)取10個(gè)不同高倍視野(×400),非肌肉橫切面視野排除在外,計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)。1.8.2血管計(jì)數(shù)和肌束計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)與肌束數(shù),并計(jì)算比值。1.8.3電子天平勻漿法取肌肉組織,于冰鹽水中漂洗,去除血污,以干紗布浸干水分后,在電子天平上稱濕重。然后將肌肉在勻漿器中剪碎,加入1mLPBS,勻漿離心后收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定VEGF質(zhì)量分?jǐn)?shù),以因子質(zhì)量(ng)/肌肉濕重(g)表示。2結(jié)果2.1大團(tuán)細(xì)胞家系形成單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)96h的體外培養(yǎng)后,有少量細(xì)胞貼壁,貼壁細(xì)胞呈梭形,棄去懸浮細(xì)胞,經(jīng)PBS浸洗后,加入培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),梭形的貼壁細(xì)胞擴(kuò)增逐漸形成細(xì)胞團(tuán)集落,培養(yǎng)7d可見大團(tuán)細(xì)胞集落形成。糖尿病動(dòng)物的單個(gè)核細(xì)胞在體外培養(yǎng)96h后,貼壁細(xì)胞相對(duì)較少,但形態(tài)各組間差異無顯著性意義。2.2梭形貼壁細(xì)胞團(tuán)的表征骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)7d后,形成的梭形貼壁細(xì)胞團(tuán),經(jīng)FITC-UEA-I和acLDL-Dii雙染色,在多波長激光共聚焦顯微鏡下觀察,均表達(dá)陽性,分別呈現(xiàn)綠色和紅色熒光。2.3骨髓epc的監(jiān)測(cè)術(shù)后第3,7,14天收集的組織切片上,均可見Brdu陽性的細(xì)胞存在,位于血管附近,但未見其形成毛細(xì)血管。2.4血管密度b組計(jì)數(shù)Ⅷ因子染色陽性的毛細(xì)血管數(shù),A、B、C3組平均每個(gè)視野毛細(xì)血管數(shù)分別為(9.29±1.63),(12.60±2.16),(12.51±1.56)個(gè)。B組毛細(xì)血管密度顯著增多,與A組比較,差異有顯著性意義,P<0.05;與C組比較差異無顯著性意義。見表1。2.5大鼠毛細(xì)管密度b組計(jì)算高倍鏡視野下血管數(shù)和肌束數(shù)的比值,A、B、C3組的值分別為0.66±0.05,0.83±0.11,0.90±0.13,其與毛細(xì)血管密度結(jié)果相符,B組比值明顯高于A組,P<0.05,與C組比較差異無顯著性意義(見表1)。2.6兩組vegf比較A、B、C3組VEGF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.22±0.05,0.30±0.07,0.31±0.08,B組VEGF顯著高于A組,P<0.05,差異有顯著性意義。C組與B組比較差異無顯著性意義(見表1)。3糖尿病大鼠epc治療的作用機(jī)制近年來,關(guān)于EPC的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)。EPC是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,它能通過自身的增殖、分化,發(fā)育形成最原始的血管結(jié)構(gòu),這種新生血管不依賴于原先是否存在有血管內(nèi)皮,與傳統(tǒng)的成年后血管形成方式,即通過血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽、分裂、增殖形成毛細(xì)血管網(wǎng)完全不同。成年個(gè)體中的EPC主要存在于骨髓和外周血中,并在某些因子的作用下動(dòng)員到缺血區(qū)域,參與血管新生。由于EPC增殖分化能力明顯高于內(nèi)皮細(xì)胞,所以由EPC形成血管的規(guī)模和循環(huán)重建的程度明顯增大。正因如此,EPC移植為缺血性疾病的治療提供了希望。糖尿病患者中,缺血性疾病的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。然而,糖尿病對(duì)EPC及移植后治療效果的影響還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),來源于糖尿病動(dòng)物骨髓的EPC受到高血糖的影響,增殖能力明顯低于血糖正常的個(gè)體。然而,糖尿病動(dòng)物的EPC經(jīng)體外擴(kuò)增,達(dá)到一定數(shù)量后(2×106)進(jìn)行自體移植,治療下肢缺血的效果與非糖尿病動(dòng)物相同。說明高血糖本身可以影響EPC的數(shù)量和增殖功能,但是在高血糖的環(huán)境中,EPC仍然可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管形成,從而起到改善供血的作用。病理切片結(jié)果顯示,在EPC移植治療的下肢缺血的糖尿病動(dòng)物肌肉中,毛細(xì)血管密度與血管數(shù)/肌束數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說明移植后的EPC促進(jìn)了毛細(xì)血管的形成,其機(jī)制可能是其在移植部位部分分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí),也可能與其表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2),促進(jìn)了VEGF的趨化,使周圍原有的血管內(nèi)皮增殖有關(guān)。Brdu標(biāo)記細(xì)胞結(jié)果顯示,移植后的EPC存活于血管周圍,甚至可見可疑的EPC形成毛細(xì)血管,進(jìn)一步證實(shí)了EPC促進(jìn)血管形成的作用。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原,具有強(qiáng)大的促進(jìn)血管生成和通透作用。同時(shí),VEGF也是一種免疫調(diào)節(jié)因子。已有研究表明,VEGF影響多種血細(xì)胞系的分化、發(fā)育和增殖。目前,已知EPC表面有VEGFR2存在,說明其功能受到VEGF的調(diào)控。本研究顯示,治療組無論有無糖尿病,肌漿中VEGF的含量均顯著增高(P<0.05),從側(cè)面說明了EPC的治療作用。其機(jī)