微生物學實驗報告

./微生物學實驗報告〔格式標準<生命科學專業(yè)>教師：黎勇目錄索引實驗一油鏡的使用和細菌的簡單染色法 3實驗二細菌的革氏染色與芽孢染色 5實驗三常用培養(yǎng)基的配制 7實驗四酵母菌霉菌的形態(tài)結構觀察及酵母死活細胞的鑒別 8實驗五、微生物大小的測定與顯微計數(shù) 10實驗六環(huán)境中微生物的檢測和分離純化 11實驗七細菌鑒定中常用的生理生化反應 12實驗八〔綜合實驗化能異養(yǎng)微生物的分離與純化 13課程名稱：微生物學實驗班級：化生系生命科學本科實驗日期：指導教師：黎勇實驗一油鏡的使用和細菌的簡單染色法〔目的要求〕學習并熟練掌握油鏡的使用技術；觀察細菌的基本形態(tài)；學習觀察細菌的運動性的基本方法?！不驹怼?.N·A=n·sinα2.D=λ/2N.A3.目鏡可提高放大倍數(shù),但有效放大率取決于鏡口率。已經分辨的物體不放大看不清,未分辨物放得再大也看不清。4.用懸滴法或凹玻片法觀察細菌的運動性時,可以通過真運動能定向地由一處快速運動來區(qū)別于顆粒的布朗運動。〔器材用具〕顯微鏡、載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水紙、擦鏡紙；細菌、放線菌等固定裝片；培養(yǎng)18小時左右的B.subtilis.S.arueus菌斜面培養(yǎng)物；無菌水、生理鹽水?！卜椒ú襟E〕：〔一油鏡的使用鏡檢裝片在中倍〔或高倍鏡下找到目的物,并使位于視野正中聚光鏡上升到最高位置,虹彩光圈開到最大,鏡頭轉開成八字形在玻片的鏡檢部位〔光斑處滴一滴香柏油油鏡轉入正下方側視小心上升載物臺〔縮短鏡頭與裝片距離,鏡頭浸入油中,至油圈不擴大為止鏡頭幾與裝片接觸粗調器徐徐下降載物臺〔密切注視視野,當捕捉到物像時,立即用細調器校正仔細觀察并繪圖取出裝片,清洗油鏡：擦鏡紙拭去鏡頭上的香柏油擦鏡紙沾少許二甲苯擦去殘留〔用手指輔助,迅速拭擦一、二次用清潔擦鏡紙仔細擦干二甲苯〔2-3次?！捕毦暮唵稳旧ǎ和科稍锘鹧婀潭ㄈ旧锤稍镉顽R觀察〔三細菌運動性的觀察取潔凈蓋玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌懸液凹玻片的凹窩向下蓋于蓋玻片上翻轉觀察〔結果分析〕1、畫一圓圈表示視野,選取所觀察的微生物繪圖,注意特殊結構、形狀和排列?！裁枥L時按視野實際大小5－10倍繪制菌名：大腸桿菌菌名：金黃色葡萄球菌放大倍數(shù)：100×10〔×5放大倍數(shù)：100×10〔×5特殊結構：無特殊結構：無視野觀察下微生物的形態(tài)2、油鏡使用時為什么必須干燥裝片？防止水油分層,光受到折射而影響油鏡性能的發(fā)揮〔實驗討論〕首次實驗中有幾個要點：一是按無菌操作取用菌；二是涂片技術的掌握；三是油鏡使用技術。凡實驗中學生的所思所想,如無菌操作技術要點、自行處理實驗材料、失敗與思考等均可進行討論〔如涂片時蒸餾水不宜過多、取用菌時防止菌被灼燙變形、取菌宜少不宜多等均是可以討論的容。實驗二細菌的革氏染色與芽孢染色〔目的要求〕觀察細菌菌落的特征；掌握簡單染色法、革蘭氏染色法的原理及操作步驟；在油鏡下觀察細菌個體形態(tài)；學習環(huán)境中微生物的檢查方法,并加深對微生物分布廣泛性的認識〔器材用具〕E.coli\B.subtilis\S.aureus.的斜面培養(yǎng)物〔18－24小時以及菌落平板各一個；染液：草酸銨結晶紫、劃蘭氏染液、盧戈氏碘、95%的乙醇、蕃紅；無菌水、顯微鏡、載片、濾紙、液體石蠟是、、擦鏡紙、接種環(huán)?！卜椒ㄈ荨常骸惨粚嶒炇噎h(huán)境中微生物的檢查〔二革蘭氏染色法涂片固定冷卻結晶紫染色1min水洗碘媒染1min95%乙醇30-60s水洗番紅復染2－3min水洗干燥油鏡鏡檢〔三芽孢染色涂片固定孔雀綠加熱染色〔勿干5min水洗番紅復染1min水洗鏡檢〔結果分析〕實驗結果被染成紫色者即為革蘭氏陽性,被染成紅色者為革蘭氏陰性；菌體染成紅色,芽孢被染成綠色。菌名：大腸桿菌菌名：金黃色葡萄球菌放大倍數(shù)：100×10〔×5放大倍數(shù)：100×10〔×5染色反應：紅色〔陰性染色反應：紫色〔陽性菌名：枯草芽孢桿菌放大倍數(shù)：100×10〔×5染色反應：紫色〔陽性圖1視野觀察下細菌的革蘭氏染色反應圖2枯草芽孢桿菌芽孢形態(tài)圖〔實驗討論〕嚴格掌握脫色程度,是成敗的關鍵。若脫色時間過度,則陽性菌初時之紫色脫出,復染成紅色,誤成陰性,反之脫色時間不足,陰性菌在初染時的紫色未能脫出,復染時不能染成紅色,誤以為陽性菌；涂片不能厚；盧弋氏碘即用即配。作業(yè)1、繪出所觀察到到細菌的視野圖,并說明染色反應。2、哪些因素會影響到革蘭氏染色結果的正確？其中是關鍵的一步是什么？菌齡及培養(yǎng)條件和染色技術是最主要的,關鍵是脫色。3、怎樣對未知菌進行革蘭氏染色,以證明你的結果的正確？與已知菌混合涂片比較。實驗三常用培養(yǎng)基的配制〔目的要求〕了解培養(yǎng)基的配制原理；了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序；了解培養(yǎng)基過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項。了解半合成培養(yǎng)基的配制原理,學習掌握肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基的配制方法?！财鞑挠镁摺车扰涓鞣N培養(yǎng)基的組成成分,瓊脂、1NNaoH溶液1NHCl天平或臺秤高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙報紙等?！卜椒ú襟E〕<一>玻璃器皿的洗滌和包裝以小組為單位清洗、控水,按9個為一組,分別用報紙包好并放入烘箱中等待滅菌。<二>液體及固體培養(yǎng)基的配制過程原料稱量〔按配方次序溶解調節(jié)ｐH過濾澄清分裝塞棉塞和包札滅菌分別按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯液體及固體培養(yǎng)基。<三>培養(yǎng)基的分裝用玻璃漏斗,橡皮管,小玻璃管及彈簧夾制作分裝裝置選用15×150平口試管或150mL錐形瓶貼上標簽分裝〔至試管高度1/4-1/3,斜面制作用1/5,半固體用1/3要求：每人制作斜面3支。其余分裝至錐形瓶中。<四>棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎分別制作試管及錐形瓶棉塞并塞好好以牛皮紙包裝頭部。<五>培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基用濕熱法滅菌；皿用干熱法分別滅菌。<六>斜面和平板的制作〔下次試驗完成<七>培養(yǎng)基的無菌檢查〔下次實驗完成<八>無菌水的制備同時制作無菌生理鹽水,置錐形瓶中備用。〔結果分析〕以斜面接種培養(yǎng)驗證培養(yǎng)基配制效果；以平板制作及接種24小時培養(yǎng)驗證滅菌效果；簡述移液管包裝的注意事項。〔實驗討論〕滅菌器的滅菌效果必須間隔一段時間,加以驗證,主要方法除無菌檢查外,還通過壓力試紙同時滅菌來驗證其壓力與溫度；培養(yǎng)基通常成批制作備用。但制作后,其貯藏時間有一定限制,一般室溫條件下不超過三周；冰箱4℃條件下可貯藏半年,過期不能用。作業(yè)：1、記錄培養(yǎng)基的成分和名稱2、分析所配制培養(yǎng)基的碳源、氮源、能源及無機鹽、維生素的來源。所配制均為天然培養(yǎng)基,各成分主要來自有機質,微量元素可以由自來水提供。3、什么是天然培養(yǎng)基？什么是半合成、合成培養(yǎng)基？實驗四酵母菌霉菌的形態(tài)結構觀察及酵母死活細胞的鑒別〔目的要求〕觀察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、個體形態(tài)、生長及繁殖方式。學習酵母死活細胞的鑒別方法?！膊牧嫌镁摺翅劸平湍?、紅酵母、假絲酵母；<釀酒酵母和紅酵母菌落平板各一個。釀酒酵母豆芽汁斜面及釀酒酵母醋酸鈉斜面各一支,假絲酵母加蓋片培養(yǎng)的平板>；7.6%孔雀綠染液,0.5%蕃紅染液,丹黑染液,二甲苯,中性紅染液,碘液；目鏡測微尺、鏡臺測微尺；載片及蓋片?！卜椒ú襟E〕<一>菌落特征的觀察<二>個體形態(tài)與出芽<三>子囊孢子的觀察<四>酵母死活細胞的觀察。〔結果分析〕描述釀酒酵母霉菌的菌落形態(tài)特征；繪圖釀酒酵母的菌體、出芽方式及細胞細節(jié)；〔一酵母的菌落濕潤,大而隆起,顏色多樣,正反面顏色一致,不透明,邊緣整齊；菌名：釀酒酵母放大倍數(shù)：100×10〔×5特殊結構：芽〔出芽繁殖〔二霉菌菌落特征：干燥,正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松?！踩缬覉D菌名：青霉〔Penicillium菌名：毛霉〔Circinella放大倍數(shù)：100×10〔×5放大倍數(shù)：100×10〔×5特殊結構：分生孢子?！仓銧罘种μ厥饨Y構：孢子囊菌名：曲霉〔Aspergillus 菌名：根霉〔Rhizopus放大倍數(shù)：模式圖放大倍數(shù)：100×10〔×5特殊結構：足細胞特殊結構：假根〔實驗討論〕作業(yè)：1、繪圖說明所觀察到的酵母菌、霉菌的形態(tài)特征。實驗五、微生物大小的測定與顯微計數(shù)〔目的要求〕學習并掌握用測微尺測定微生物細胞大小的方法；了解血細胞計數(shù)板的構造及計數(shù)原理,掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法?！膊牧嫌镁摺称【平湍福伙@微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺；血球計數(shù)板；蓋玻片,載玻片,滴管,試管,無菌水,〔方法步驟〕<一>酵母細胞大小測定<1>目鏡測微尺的校正<2>細胞大小的測定<二>顯微計數(shù)法<1>鏡檢計數(shù)室<2>菌懸液制備及加樣<3>計數(shù)<4>清洗計數(shù)板〔結果分析〕結果記錄入表中。1、目鏡測微尺的標定結果〔精確到零點幾小格物鏡倍數(shù)〔目鏡均為10倍

目鏡測微尺的格數(shù)〔小格

鏡臺測微尺的格數(shù)〔小格

目鏡測微尺的每格的長度〔μm

40倍

2、酵母菌大小測定結果菌號

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

目鏡測微尺的格數(shù)〔小格

長軸

短軸

酵母大小平均值＝±〔保留小數(shù)點后2位長軸＝短軸＝3、血細胞計數(shù)板對酵母菌懸液計數(shù)結果實驗次數(shù)

各中格中菌數(shù)

總菌數(shù)

稀釋倍數(shù)

平均值

菌數(shù)<個/mL>

1

2

3

4

5

6

7

8

9

〔實驗討論〕作業(yè)：1.什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時,必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺校正。2.. 根據實驗體會說明血細胞計數(shù)法的誤差主要來自哪些方面？如何減少誤差？3.. 在滴加菌液時,為什么要先置蓋玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置蓋玻片？4.. 用血球計數(shù)板測定微生物數(shù)量時,哪些步驟易造成誤差？如何預防？計算細胞數(shù)目時此法是否可以適用？實驗六環(huán)境中微生物的檢測和分離純化〔目的要求〕1、學習并掌握各種無菌操作技術,并用此技術進行微生物的劃線分離接種2、學習掌握平板菌落計數(shù)法〔基本原理〕土壤是微生物生活的大本營,是生物多樣性的重要場所,也是發(fā)揚微生物資源的重要基地,可以從中分離純化得到許多的菌株。劃線法是常用的分離與純化方法,通過無菌操作條件下,"漸劃漸稀"的效應而得到菌落純的菌株。平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經過適當稀釋,使其中的微生物充分分散形成單個細胞,取一定量的稀釋樣液接種到平板上,經過培養(yǎng),由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落,即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù),根據其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌量。這種方法為活菌計數(shù)法,廣泛應用于生物制品及污染程度〔含菌指數(shù)的檢測。〔材料與用品〕土樣10g,無菌平皿〔20套及無菌水,牛肉膏蛋白胨平板〔2只；取液器〔0.5mL及1mL各三支；無菌有帽試管,三角瓶,無菌涂棒,接種環(huán),記號筆,酒精燈,火柴,試管架〔方法步驟〕1、周圍環(huán)境中微生物的檢測平板分4個區(qū)做好標記用未洗的手指及肥皂洗過的手指〔1次、2次、3次,或其它分別在四個區(qū)上涂抹倒置到37℃培養(yǎng)24小時觀察結果。2、土壤中微生物分離純化及平板計數(shù)采土樣〔5－20cm土10g,裝入到已滅菌的牛皮袋〔信封中,封好袋口1.0g加入99mL無菌水〔三角瓶中1mL無菌吸管0.5mL加入到4.5mL無菌水試管中,吹吸三次,振蕩均勻<10-3>。同法得10－4－10－6土壤溶液用接種環(huán)沾取10-2土壤懸液在已經凝固的平板表面進行劃線分離分別取各濃度土壤懸液0.1mL對號均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨平板,用無菌涂棒涂勻〔多涂幾遍。每個濃度做3個平板?！步Y果分析〕1、有較大片菌苔生長時,棄用。2、選擇平均菌落數(shù)在30－300之間的平板。只有一個濃度符合此圍時,以該平均菌落數(shù)為準；有兩個濃度的平板菌落數(shù)在30－300之間時,按兩者的總數(shù)平均決定,比值小于2,取平均,比值大于2則取較少的菌落總數(shù)。所有菌落數(shù)大于300,取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)；所有菌落數(shù)均小于30,取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)〔即當所有菌落數(shù)均不在30－300之間時,此實驗的精確度要求下,可以最接近30或300的菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)?！矊嶒炗懻摗惩寥乐械木鷶?shù)量在哪個數(shù)量級？你分離的微生物主要有哪些種類？為什么？105數(shù)量級,主要是細菌,也有酵母。主要通過其菌落特征來判斷。細菌的菌落為濕潤,其正反面顏色一般一致,普遍比較小。酵母的菌落濕潤,大而隆起,顏色多樣,正反面顏色一致,不透明,邊緣整齊；而霉菌菌落特征：干燥,正反面及中央與邊緣不一致；大而疏松。實驗七細菌鑒定中常用的生理生化反應〔目的要求〕了解細菌生理生化反應原理,掌握細菌鑒定中常用的生理生化反應方法；通過對不同細菌對不同含碳、氮化合物的分解利用情況,了解基代多樣性；學習不同培養(yǎng)基基中的不同生長現(xiàn)象及其代產物在鑒別細菌中的意義?！矊嶒炘怼掣鞣N細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同,對營養(yǎng)基質的分解能力也不一樣,因而代產物存在差別。細菌的這種代方式可供鑒別細菌之用。用生理生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代作用及其代產物,從而鑒別細菌的種屬,稱為細菌的生理生化反應。有些細菌能發(fā)酵葡萄糖,而不能分解乳糖；有些細菌能分解某種糖產生有機酸和氣體；有的細菌則只產酸不產氣。在配制培養(yǎng)基時預先加入溴甲酚紫〔ｐH4.4紅色～ｐH6.2黃色,當發(fā)酵產酸時,培養(yǎng)基由紫色變黃,氣體的產生則可由試管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來判斷。大腸桿菌不產生丁二醇,V.P.試驗為陰性。其進行混合酸發(fā)酵,故甲基紅試驗為陽性。產氣桿菌則進行丁二醇發(fā)酵,V.P試驗為陽性,甲基紅試驗為陰性?！膊牧嫌镁摺矱.coli,變形桿菌,枯草芽孢桿菌,產氣桿菌,糞水中分離的未知菌種斜面,糖發(fā)酵培養(yǎng)基；超凈工作臺,恒溫培養(yǎng)箱,試管,移液管,杜氏小管。甲基紅試劑、V.P.試劑。〔實驗步驟〕各取4支相應的培養(yǎng)基,標記好發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱、所接菌種名及組號,1支接大腸桿菌,1支接變形桿菌,1支接未知斜面菌種,1支不接。1、糖發(fā)酵試驗2、甲基紅試驗3、V.P.試驗接種后37℃分別培養(yǎng)24h、48h、48h,觀察實驗結果,將實驗結果填入表中?！矊嶒灲Y果〕表7－1實驗結果編號

大腸桿菌

枯草芽孢桿菌

產氣桿菌

未知菌

CK

葡萄糖發(fā)酵

乳糖發(fā)酵

甲基紅實驗

V.P.試驗

〔實驗討論〕如：討論通過哪些生理生化反應可以區(qū)分大腸桿菌,產氣桿菌？大腸桿菌不產生丁二醇,V.P.試驗為陰性。其進行混合酸發(fā)酵,故甲基紅試驗為陽性。產氣桿菌則進行丁二醇發(fā)酵,V.P試驗為陽性,甲基紅試驗為陰性。實驗八〔綜合實驗化能異養(yǎng)微生物的分離與純化[目的要求]1．掌握細菌、放線菌、酵母苗和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術。2．學習從樣品中分離、純化出所需菌株。3．學習并掌握平板傾注法和斜面接種技術,了解培養(yǎng)細菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。4．學習平板菌落計數(shù)法。[基本原理]土壤是微生物生活的大本營,是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同,一般土壤中細菌數(shù)量最多,其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥,偏堿性、有機質豐富的土壤中放線苗數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少,而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實驗從土壤中分離細菌、放線菌和霉菌；白面曲<發(fā)面用的引子>或酒曲或果園土中分離酵母菌。為了分離和確保獲得某種微生物的單苗落,首先要考慮制備不同稀釋度的苗懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次,應考慮各類微生物的不同特性,避免樣品中各類微生物的相互干擾。細菌或放線苗在中性或微堿性環(huán)境較多．但細菌比放線萌生長快,分離放線菌時,一般在制備土壤稀釋液時添加10%酚或在分離培養(yǎng)基中加相應的抗生素以抑制細菌和霉菌<如加鏈霉素25-50μgmL以抑制細菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌靈30μ／mL以抑制霉菌>；酵母苗和霉菌都喜酸性環(huán)境,一般酵母菌只能以糖為碳源,不能直接利用淀粉,酵母菌在pH5時生長極快。而細菌生長適宜的酸堿度為pH7,所以分離酵母菌時只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH,可降低細菌增殖率,霉菌生長慢,也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌,需降低細菌增殖率,一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計數(shù),分離霉菌時常在培養(yǎng)基中加入化學抑制劑。要想獲得某種微生物的純培養(yǎng),還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間見表所示。[材料與用品]1.菌源選定采土地點舌。鏟去表土層2～3cm,取3～10cm深層土壤10g,裝入已滅過菌的牛皮紙袋．封好袋口,并記錄取樣地點、環(huán)境及日期。土樣采集后應及時分離,凡不能立即分離的樣品,應保存在低溫、干燥條件下,盡量減少其中菌種的變化。從面曲中分離酵母菌。也可用酒曲等替代。2．培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基<制平板和斜面,3．無菌水或無菌生理鹽水配制生理鹽水．分裝于250mL錐形瓶中,每瓶裝99mL<或95mL分離霉菌用>,每瓶裝10粒玻璃珠；分裝試管,每管裝約4.5-5mL<不超過試管高度的1／5>。4．其他試劑與用品無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒<刮刀>、稱量紙、藥匙、洗耳球、10％酚溶液。[實驗步驟]1．稀釋分離法平板分離菌有傾注法和涂布法兩種。本次實驗分離細菌、放線菌、霉菌時采用傾注法,酵母菌分離采用涂布法：<1>細菌的分離1>制備土壤稀釋液稱取土樣1g,在火焰旁加入盛有99mL并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．振蕩10一20min,使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散,制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離,以制備10-2稀釋度為例,具體操作過程如下：取4.5mL無菌水試管6支,按10-210-7順序編號,放置在試管架上。取無菌移液管一支,從移液管包裝紙?zhí)字虚g撕口,將包裝紙?zhí)追殖缮?、下兩?去除下段包裝紙?zhí)?在移液管上端管口裝橡皮頭,取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂?以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭,將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰2～3次,殺滅撕紙?zhí)讜r可能污染的雜菌,切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底,以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞,在火焰旁拔出棉塞<棉塞夾在于上,不能亂放在桌上>,將lmL移液管的吸液端伸進振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部,用手指輕按橡皮頭,在錐形瓶反復吹吸二次<吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面>,然后準確吸取0.5mL10-2土壤稀釋液,右手將棉塞插回錐形瓶上,左手放下錐形瓶,換持一支盛有4.5mL無菌水的試管,依前法在火焰旁拔除試管帽<或棉塞>,將0.5m10-2土壤稀釋液注入4.5m1無菌水試管,制成l0-3的土壤稀釋液,將此移液管通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)?以備再用。另取一只未用過的無菌移液管在試管反復吹吸三次,然后取出移液管,并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)?以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20～30次。混勻土壤稀釋液。再從紙?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗?插入稀釋液已搖勻的試管,再吹吸三次,然后準確吸出o.5mL10-3的稀釋液。置第二支裝有4.5m1無菌水試管,制成10-4：土壤稀釋液。用同法再制成10-5、10-6、10一7的土壤稀釋液<為避免稀釋過程誤差,進行微生物計數(shù)時,最好每一個稀釋度更換一支移液管>：最后用的移液管重新放人紙?zhí)?。待滅菌?再洗刷或將用過的移液管放在廢棄物筒中．用3%-5%來爾浸泡lh后再滅菌洗滌。2>傾注法分離取無菌培養(yǎng)皿6-9套,分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后,用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1mL稀釋液,按無菌操作技術加到和應編號的無菌培養(yǎng)皿。再依同方法分別吸取1mLl0-6、10-5的土壤稀釋液,各加到和應編號為10-6、10-5的無菌培養(yǎng)皿。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化,待冷卻至45-50度左右,分別傾入到已盛有I0-5、10-6、10-7土壤稀釋液的無菌培養(yǎng)皿。注意：溫度過高易將菌燙死,且皿蓋上冷凝水太多,會影響分離效果；低于45％培養(yǎng)基易凝固,平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。傾倒培養(yǎng)基時注意無菌操作,要在火焰旁進行。左手拿培養(yǎng)皿,右手拿錐形瓶底部,左手同時用小指和手掌將棉塞拔開,灼燒瓶口．用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫,至瓶口正好伸入,傾入培養(yǎng)基約12-15mL,將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉動,使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻．混勻后靜置桌上,待凝。3>培養(yǎng)待平板完全冷凝后,將平扳倒置于35-37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24～48h觀察結果。<2>放線菌的分離1>制備土壤稀釋液稱取土樣lg,加入盛有99m1并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液<抑制細菌生長,可用l％的重鉻酸鉀溶液代替lo%酚溶液．效果更好>。振蕩后靜置5min,即成10-2土壤稀釋液。2>傾注法分離按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-3、10-4、10-5三個稀釋度,然后用無菌移液管依次分別吸取lmL10-5、l0-4、10-3土壤稀釋液于對應編號的無菌培養(yǎng)皿,用高氏合成1號培養(yǎng)基依前法傾倒平板,每個稀釋度做2～3個平行培養(yǎng)皿。理鹽水,振蕩20min,即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園上樣,也依前法稱取土樣,制成10-2壤稀釋液。3>涂布法分離依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化并冷卻至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基,待平板冷凝后,用無菌移液管分別吸取上述l0-6、l0-5、10-4三個稀釋度苗懸液0.1mL,依次滴加于對應編號已制備好的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無菌玻璃涂棒,左手拿培養(yǎng)皿,并用拇指將皿蓋打開一縫,在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴散,切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或將培養(yǎng)基劃破。4>培養(yǎng)接種后,將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)2～3d觀察結果。2劃線分離法菌種被其他雜苗污染時或混合菌懸液常用劃線法進行純種分離。此法將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線,使混雜的微生物細胞在平板表面分散,經培養(yǎng)得到分散成由單個微生物細胞繁殖而成的菌落,從而達到純化目的。平板制作方法如前所述。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好,需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線,一般培養(yǎng)基不宜太薄,每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)基應厚薄均勻,平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。<1>連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點開始,連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止,當中不需灼燒接種環(huán)上的菌。以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處,取出接種,燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸人平板,在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻．然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時平板面與接種環(huán)面成30～40°的角度,以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基劃破培養(yǎng)基,線條要平行密集,充分利用平板表面積,注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢,關上皿蓋。灼燒接種環(huán),待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)<以免培養(yǎng)過程中皿蓋冷凝水滴下,沖散巳分離的菌落>。培養(yǎng)后在劃線甲板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài),涂片鏡檢為純種后再接種斜面。<2>分區(qū)劃線法平板分四區(qū),故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時每次將平板轉動60一70°劃線,每換一次角度,應將接種環(huán)上的菌燒死后,再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、接種、培養(yǎng)方法與連續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個區(qū),其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū),故其劃線面積應最大。為防止第四區(qū)劃線與l、2、3區(qū)線條和接觸,應使4區(qū)線條與l區(qū)線條和平行,這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)