neurian對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元修復(fù)與再生的影響

neurian對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元修復(fù)與再生的影響

控制神經(jīng)塑性神經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和損傷一直是臨床難題之一。目前，神經(jīng)激素（ntfs）的臨床治療主要是營(yíng)養(yǎng)因子（ntfs）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以為神經(jīng)重建提供良好的微環(huán)境，這在防止神經(jīng)退變和促進(jìn)神經(jīng)波動(dòng)方面發(fā)揮著非常重要的作用。它們?cè)诰S持神經(jīng)元存活、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和分化及調(diào)節(jié)突觸形成與可塑性的過(guò)程中起著重要作用。而Neuritin是一種新的與神經(jīng)可塑性相關(guān)候選15(CPG15,candidateplasticity-relatedgene15)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。已知Neuritin是神經(jīng)活動(dòng)和NTFs發(fā)揮作用的共同下游因子,與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)。Neuritin是NGF發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)作用的一個(gè)關(guān)鍵因子?；贜euritin的功能和對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)病變的作用,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔置管將Neuritin移植到脊髓損傷局部,檢測(cè)Neuritin對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)元軸突修復(fù)與再生的作用。1材料和方法1.1蛋白、神經(jīng)中絲、agts和alas公司的抗Neuritin蛋白為純凍干粉(99.31%),由本課題組提供,HIS蛋白(HisTags)購(gòu)自北京博奧森公司;兩者在使用時(shí)生理鹽水稀釋至6ug/100uL。神經(jīng)中絲(NF200)大鼠單抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京博奧森公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組健康Wistar大鼠56只,8-9周齡,體重250g~300g,購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)兩周后,將上述56只大鼠分為6組,每組8只。(1)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各24只Wistar大鼠,設(shè)6h組,3d組,7d組,14d組,28d組,56d組;(2)陰性對(duì)照組(n=8),實(shí)驗(yàn)組(n=24)和對(duì)照組(n=24)。1.3治療t0節(jié)段術(shù)前大鼠實(shí)行單籠飼養(yǎng)一周,提前6h禁食水。備皮,10%的水合氯醛以300mg/kg行腹腔麻醉,麻醉成功后,沿背正中切口暴露T8~T12棘突及椎板,在暴露的脊髓處放自制墊片,以保證受力均勻。采用改良Allen’s打擊法,以300gcm(15g×20cm)f造成T10節(jié)段急性脊髓損傷,損傷處約20秒后出現(xiàn)水腫、淤血,可見擺尾反射,雙下肢及軀體回縮撲動(dòng),表明打擊成功。充分暴露出T10節(jié)段手術(shù)視野,蛛網(wǎng)膜下腔插入自制給藥導(dǎo)管(內(nèi)徑約0.1mm),,給藥端朝向頭部,以肝素帽套封口,依次縫合軟組織及皮膚。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在術(shù)后經(jīng)導(dǎo)管連續(xù)給予Neuritin100ul(6ug)或HIS蛋白100ul(6ug)一周。陰性對(duì)照組只打開椎板不打擊,單純蛛網(wǎng)膜下腔埋植空管。一周后拔除導(dǎo)管。1.4大鼠雙術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能的觀察和評(píng)分采用BBB后肢功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。各組大鼠分別于各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)放在75×125cm的開放空間,采用雙人、雙盲法獨(dú)立觀察大鼠雙后肢的運(yùn)動(dòng)功能并記錄評(píng)分。結(jié)果以x±s表示。1.5髓組織病理學(xué)檢測(cè)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的損傷區(qū)脊髓組織5mm,10%中性緩沖液在4°條件下固定,常規(guī)蠟塊包埋,連續(xù)切片,切片厚度5um。從樣本中隨機(jī)抽取2張切片HE染色,觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本隨機(jī)選擇2張切片,每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野,用Image-ProPlus分析軟件進(jìn)行圖像分析,測(cè)定陽(yáng)性產(chǎn)物的累加積分光密度值(IODSUM)和面積(AREASUM),計(jì)算平均密度值(Meandensity,IOD/AREA),IOD/AREA值越大表示陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng)。1.6活性物質(zhì)的檢測(cè)損傷的脊髓組織充分剪碎,加入RIPA裂解緩液裂解,冰上裂解30min后,于4℃離心25min,取上清液,BCA試劑測(cè)定蛋白含量后,1xSDS凝膠加樣緩沖液調(diào)蛋白濃度使各組蛋白含量一致,在100°C水中煮8min使蛋白質(zhì)完全變性。10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)NF膜。用含5%脫脂奶粉的1XTBST封閉一小時(shí),用1:2000加入兔抗鼠NF200一抗于4℃冰箱過(guò)夜,TBST洗3次,每次10min.1:4000加入辣根過(guò)氧化物酶二抗(SigmaAldrich美國(guó)),室溫一小時(shí),TBST洗3次,每次10min。用westernblot熒光檢測(cè)試劑盒顯示結(jié)果與X光片。Epson1650photo掃描儀收集圖片,用LabworkS圖像分析系統(tǒng)對(duì)Westernblot結(jié)構(gòu)吸光度掃描,以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。1.7數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析文章數(shù)據(jù)采用均數(shù)-+標(biāo)準(zhǔn)數(shù)表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,進(jìn)行單因素方差分析,方差齊時(shí)采S-N-K檢驗(yàn),方差不齊采用TamhanesT2檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的比較,單因素方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21bcb評(píng)分的不同檢測(cè)方法各組BBB評(píng)分總體呈增高趨勢(shì),其中各組大鼠第3d和第7dBBB評(píng)分未見明顯差異(P>0.05),從第14d開始,可以看到Neuritin實(shí)驗(yàn)組評(píng)分明顯高于HIS蛋白對(duì)照組,差別均有顯著性(P<0.05)。詳見表1.1和圖表1.23.2神經(jīng)突變事件各組大鼠損傷后第3d大鼠神經(jīng)元核固縮、淡染、數(shù)量減少;尼式小體淡染、數(shù)量減少,損傷區(qū)可見大量空泡細(xì)胞出現(xiàn);神經(jīng)突觸數(shù)量減少、消失。從第7d開始,可以看到Neuritin實(shí)驗(yàn)組較HIS蛋白對(duì)照組,尼式小體染色加深,空泡細(xì)胞減少,神經(jīng)突觸數(shù)量增多(見圖2.1~2.10)。2.3大鼠骨髓內(nèi)的光密度值NF200免疫組化觀察發(fā)現(xiàn),損傷后3d,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組白質(zhì)內(nèi)均只見少量NF200棕褐色著色點(diǎn)。從第7d開始,NF200在各組大鼠脊髓內(nèi)均有表達(dá),主要呈棕黃色的細(xì)絲狀(軸突出芽),在灰質(zhì)中的主要表達(dá)在生長(zhǎng)錐,呈棕黃色突起,可見細(xì)絲狀表達(dá)(見圖3-0至3-9)。經(jīng)用Image-ProPlus分析軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)算平均光密度值(Meandensity,IOD/AREA),從第7d開始,各時(shí)間點(diǎn)Neuritin實(shí)驗(yàn)組均高于HIS蛋白對(duì)照組,差異有顯著性(P<0.05)。詳見表2.1,圖表2.2。2.4nf200表達(dá)性能免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3天后其NF200表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的含量均表達(dá)上調(diào),而實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的上調(diào)表達(dá)量(P<0.05),說(shuō)明NF200表達(dá)上調(diào)水平與Neuritin的用量相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,差異具有顯著性(P<0.05),結(jié)果詳見下圖3。3治療軸突和樹突Neuritin是與神經(jīng)祖細(xì)胞分化和移行有關(guān)的基因,亞細(xì)胞定位顯示,Neuritin蛋白集中表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞體和在腦的無(wú)髓鞘區(qū),沿著神經(jīng)突起不均衡彌散分布,能夠促進(jìn)軸突出芽、神經(jīng)突起生長(zhǎng)和棘突的形成。在胚胎海馬和皮質(zhì)培養(yǎng)物中,純化的Neuritin重組蛋白能促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長(zhǎng),并能促進(jìn)其分支的形成;能抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的凋亡,維持神經(jīng)元的存活。Neuritin蛋白出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突和乙酰膽堿受體簇附近的突觸前軸突分支,而且Neuritin還是雄性激素介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突向外生長(zhǎng)的分子調(diào)節(jié)器。Neuritin能通過(guò)增加和維持額外分支,減少分支回縮將動(dòng)態(tài)平衡轉(zhuǎn)向軸突生長(zhǎng)。Di等首次報(bào)道大鼠脊髓損傷后,Neuritin與整合素、髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白和微Neuritin管相關(guān)蛋白協(xié)調(diào)表達(dá)在有絲分裂期后的神經(jīng)元,并與1A蛋白協(xié)同促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)。脊髓損傷后Neuritin基因簇表達(dá)時(shí)間性和空間性調(diào)節(jié)為神經(jīng)再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)提供了有利的微環(huán)境;這樣也促進(jìn)了Neuritin通過(guò)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的軸突和樹突的作用,使的受傷的神經(jīng)元得到較快的修復(fù),同時(shí)也加速了神經(jīng)元的再生。本實(shí)驗(yàn)采用蛛網(wǎng)膜下腔植管的鞘內(nèi)給藥法,該實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組模型,用BBB評(píng)分法,HE染色,免疫組織化學(xué)法和Westernblotting分析檢測(cè)Neuritin對(duì)急性損傷組織的治療,探討Neuritin對(duì)急性脊髓損傷的作用。結(jié)果顯示(1)六組BBB評(píng)分總體觀察,第6h,第3d和第7d的BBB評(píng)分未見明顯差異(P>0.05),自第14d以后,實(shí)驗(yàn)組評(píng)分明顯高于His蛋白對(duì)照組,差別均有顯著性(P<0.05)。因此,SCI后早期給予外源性Neuritin可以明顯改善脊髓損傷后的神經(jīng)功能,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。(2)由免疫組織化學(xué)圖片分析,經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值(IOD/AREA).各時(shí)間點(diǎn)Neuritin組均高于His蛋白組,差異有顯著性(P<0.05);Westernblotting方法檢測(cè)顯示:各時(shí)間點(diǎn)的Neuritin組表達(dá)的相對(duì)密度值均高于對(duì)照組(H