萬拉法新慢性給藥對游泳大鼠下丘腦和蛋白表達(dá)的影響

萬拉法新慢性給藥對游泳大鼠下丘腦和蛋白表達(dá)的影響

強制游泳作為一種受體行為，可導(dǎo)致大鼠滅絕行為，并誘導(dǎo)某些核電站區(qū)域c-fos和c-jun蛋白的出現(xiàn)水平增加?？挂钟羲幙梢赃x擇性地抑制強迫游泳的大鼠的非運動時間，提高對反應(yīng)的耐受性，同時實時反應(yīng)遺傳因素（ieg）中c-fos和c-jun作為神經(jīng)元活動的定位和功能指標(biāo)，近年來，抗抑郁藥藥理機制的作用引起了越來越多的關(guān)注。但急性和慢性給予抗抑郁劑對強迫游泳誘導(dǎo)大鼠下丘腦內(nèi)不同區(qū)域中c-fos和c-jun表達(dá)水平的影響尚未見報道。本研究通過采用特異性抗體的原位免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測c-fos和c-jun蛋白,探討急性和慢性給予抗抑郁劑萬拉法新(venlafaxine)對游泳應(yīng)激后大鼠下丘腦某些核團內(nèi)c-fos和c-jun表達(dá)的影響規(guī)律。1材料和方法1.1藥品的注射采用成年雄性SpraquiDawlay大鼠24只,體重200~250g,隨機分為急性給藥組、慢性給藥組和對照組,籠養(yǎng),每籠4只,自由進食、飲水,自然晝夜節(jié)律光照。鹽酸萬拉法新(純度99%)由重慶醫(yī)學(xué)工業(yè)研究院提供,注射前溶于蒸餾水,配制成所需濃度。急、慢性給藥組和對照組大鼠各8只。慢性給藥組大鼠每天上午8:00~9:00腹腔內(nèi)注射鹽酸萬拉法新5mg·kg-1,連續(xù)7天。急性給藥組前6天同一時間注射等體積生理鹽水,第7天注射萬拉法新25mg·kg-1。對照組7天中均注射等體積生理鹽水。各組均于第7天注射后30min立即進行強迫游泳。將大鼠放入高30cm,直徑20cm,水深20cm玻璃缸內(nèi),水溫25℃,強迫游泳10min,并累計10min內(nèi)不動時間。1.2大聚甲醛/paes膠法所有大鼠均于強迫游泳結(jié)束后3h給予戊巴比妥鈉深麻醉(55mg·kg-1),剖開胸腔后,經(jīng)升主動脈快速灌注37℃生理鹽水250ml,繼之灌注4℃4%多聚甲醛(用PBS配制,PH=7.4)200~250ml,持續(xù)0.5~1h,然后剝離鼠腦修塊,置于同樣濃度的多聚甲醛固定液中24h以上,經(jīng)石臘包埋后,連續(xù)進行冠狀切片,片厚約5um,用涂有APES膠的載玻片撈片。1.3免疫組化檢測上述石臘切片常規(guī)脫蠟至水,用3%H2O2-甲醇溶液37℃孵育30min,0.1%胰酶(滴加)37℃孵育15min,2%BSA(小牛血清蛋白)37℃孵育2h。滴加免抗多克隆fos抗體(sigma)(稀釋度1∶200)或免抗多克隆jun抗體(sigma)(稀釋度為1∶200),37℃孵育2h或4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記的單抗免IgG(Zymed公司),稀釋度1∶100,37℃孵育30min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Zymed公司),稀釋度為1∶100,37℃孵育15min。DAB顯色,顯微鏡下控制顯色時間3~5min,自來水沖洗,終止顯色反應(yīng),最后脫水透明和封片,上述各步驟之間均用0.01mol/LPBS沖洗3×5min。1.4局部免疫反應(yīng)對各組的每只動物各取具有下丘腦的室旁核(PVN)和視上核(SON)切片(10±1)張在計算機圖像分析系統(tǒng)(NIAS-2000)上分別測量下丘腦內(nèi)fos和jun陽性細(xì)胞相對切面面積比(陽性細(xì)胞面積和占視場面積的百分比)和平均目標(biāo)灰度值(所測陽性細(xì)胞平均灰度),灰度單位分為256個等級,免疫反應(yīng)的強弱與灰度值呈反比關(guān)系,對每只動物所測量的切片得出的數(shù)據(jù)取平均值,結(jié)果采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。2結(jié)果2.1不動時間的影響萬拉法新慢性給藥(5mg·kg-1)可明顯縮短強迫游泳大鼠的不動時間;但急性給藥(25mg·kg-1)對強迫游泳大鼠的不動時間沒有明顯縮短趨勢,與對照組相比,無顯著性差異(P>0.05)。2.2fos和digital圖像分析光鏡下觀察,強迫游泳應(yīng)激后3h的fos和jun蛋白免疫反應(yīng)物質(zhì)呈棕色顆粒狀,位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi),fos蛋白的表達(dá)以PVN和SON最為密集,且主要集中于室旁核小細(xì)胞部(pPVN)及穹窿周圍,jun的表達(dá)主要集中于視上核、背內(nèi)側(cè)核(DMN)和結(jié)節(jié)內(nèi)核(MT)及正中隆起,下丘腦的外測區(qū)亦有較強的fos和jun蛋白表達(dá),但與上述部位相比染色較弱,經(jīng)過計算機圖像分析后,結(jié)果見表1。3抗抑郁藥對c-fos和c-digital-藥物代謝的調(diào)節(jié)作用即時反應(yīng)基因c-fos和c-jun作為一組非特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,近年來被應(yīng)用到研究精神藥物調(diào)節(jié)靶基因的作用機理之中。由于fos和jun蛋白可以形成同源或異源二聚體,從而改變自己與DNA的結(jié)合特異性,增加AP-1結(jié)合活性,參與信號傳遞系統(tǒng)各效應(yīng)酶的轉(zhuǎn)錄過程,調(diào)控其它多種基因的表達(dá)的靶蛋白合成,因而可以通過c-fos和c-jun的示蹤作用,來探索精神藥物作用于哪些特定的腦區(qū)。神經(jīng)元c-fos和c-jun的表達(dá)一般認(rèn)為具有普通性,即幾乎任何形式的刺激只要達(dá)到一定的強度和持續(xù)時間,都可以引起中樞c-fos和c-jun表達(dá)。但另一方面又表現(xiàn)自身的特異性,即不同形成的刺激誘導(dǎo)表達(dá)的部位不同,并且反復(fù)同一形式的刺激可產(chǎn)生表達(dá)的“耐受性”或“習(xí)慣性”,另外,不同形式的刺激引起中樞c-fos和c-jun的表達(dá),相互之間不存在“交叉耐受”。本研究在慢性給藥過程中,使大鼠對腹腔注射,抓捉等刺激產(chǎn)生了適應(yīng)性,從而排除了這些應(yīng)激對c-fos和c-jun表達(dá)的誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示,強迫游泳對下丘腦室旁核、視上核、下丘腦外側(cè)區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)核及正中隆起內(nèi)c-fos和c-jun的表達(dá)均產(chǎn)生了一定的誘導(dǎo)作用。而慢性給予萬拉法新可減弱下丘腦SON和PVN內(nèi)c-fos和c-jun的表達(dá),這說明慢性給予抗抑郁藥對c-fos和c-jun表達(dá)水平存在一定程度的下調(diào)作用。機體處于抑郁或應(yīng)激狀態(tài)時,下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)功能出現(xiàn)亢進,而抗抑郁藥對功能亢進的PHA軸具有調(diào)節(jié)作用。在本研究中,慢性給予萬拉法新可明顯縮短強迫游泳大鼠的不動時間,抑制大鼠絕望行為,因此,下丘腦可能是介導(dǎo)抗抑郁藥對抗大鼠絕望行為的中樞部位之一。另外,下丘腦室旁核是分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH)重要中樞結(jié)構(gòu)。已有研究證實,下丘腦釋放的CRH可以刺激PVN神經(jīng)元中c-fos的表達(dá),而注射CRH拮抗劑a-helicalCRH則能顯著減少下丘腦PVN神經(jīng)細(xì)胞c-fos的表達(dá),說明機體處于抑郁或應(yīng)激時,可以通過CRH的釋放或HPA軸活性改變來誘導(dǎo)c-fos的表達(dá),而c-fos蛋白又可以反饋地調(diào)控CRH基因和其它靶基因的活性,從而調(diào)節(jié)相關(guān)遞質(zhì)(或激素)的合成,而發(fā)揮第三信使作用。Imaki研究發(fā)現(xiàn),在CRH基因的啟動子上存在PA-1序列,fos/jun二聚體可能對CRH的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn),抗抑郁藥可以使強迫游泳誘導(dǎo)的c-fos/c-jun表達(dá)水平下調(diào),這種下調(diào)的機制是否與fos/jun二聚體調(diào)節(jié)CRH的轉(zhuǎn)錄過程有關(guān),需要進一步研究證實。雖然多種急性應(yīng)激可以誘導(dǎo)下丘腦c-fos/c-jun的表達(dá),但在本研究中急性一次性給藥對強迫游泳大鼠下丘腦的c-fos/c-jun表達(dá)水平的下調(diào)作用并不明顯。既往亦有研究證實,慢性電休克處