替米考星脂質(zhì)體的制備工藝研究

替米考星脂質(zhì)體的制備工藝研究

替米考星（ts）是一種由泰樂菌素半合成的特殊類禽肉素。脂肪溶解度高?？诜推は伦⑸浜?，吸收迅速，血中半衰期長，組織滲透性強，體內(nèi)分布較大。臨床上主要用于治療畜禽感染性疾病,特別是畜禽呼吸道疾病如家畜放線桿菌性胸膜肺炎、巴氏桿菌病和雞霉形體病等,對革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌、霉形體及螺旋體等均有抑制作用。但它的毒副作用,包括心臟毒性和腎臟毒性,影響了其在臨床上的應(yīng)用。用脂質(zhì)體包裹該藥后,可增加藥物的穩(wěn)定性,還可明顯減輕心臟毒性和腎臟毒性。本研究對替米考星的制備工藝和條件進(jìn)行了初步研究,擬為臨床提供一種高效、低毒的替米考星新制劑。1儀器、試劑和儀器RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞容生化儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵(SH2-DⅢ),鞏義市英峪予華儀器廠;超聲波細(xì)胞粉碎機(JY92Ⅲ-2D),寧波新芝生物科技有限公司;精密酸度計(PHS-2C),上海雷磁儀器廠;精密電子天平(SartoriusBS110s),德國賽多利斯集團;ShimadzuLC-10A高效液相色譜儀(UV檢測器),日本島津;紫外可見分光光度計(TU-1800),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;激光衍射粒度分析儀(MalvernZetasizer-3000HS),英國;透射電子顯微鏡(JEM-1230),日本。替米考星對照品,批號K0310711,含量91.0%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;替米考星原料,含量85.0%,批號20080423,山東九隆精細(xì)化工有限公司;注射級大豆卵磷脂,PC含量94.0%,上海太偉藥業(yè)有限公司;膽固醇,純度95%,廣東南方化玻有限公司進(jìn)口分裝;SephadexG-50,粒子100～200μm,PharmaciaCO.,進(jìn)口分裝;檸檬酸,上海試劑一廠;二水合檸檬酸三鈉,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。2方法和結(jié)果2.1采用ph梯度法制備聚吡咯脂tilmicsinlip，tsl2.1.1w/o相乳劑的制備將適量的大豆卵磷脂和膽固醇按一定比例混合,加入適量的無水乙醚,超聲溶解,然后加入檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(濃度為0.3mol/L,pH為4.0),水浴超聲10min,直至形成穩(wěn)定的W/O相乳劑;在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚,達(dá)到膠態(tài)后,梨形瓶上的凝膠脫落,然后再繼續(xù)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),制得脂質(zhì)體混懸液,用細(xì)胞粉碎機超聲5min,即得粒徑較小的空白脂質(zhì)體。2.1.2替米考星脂質(zhì)體的制備向“2.1.1”項下的空白脂質(zhì)體中加入30mg替米考星,超聲溶解,用1.0mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)外水相pH為7.4,在37℃水浴中孵育20min,即得替米考星脂質(zhì)體。2.2采用最佳-美國明星分析方法的建立2.2.1流動相乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺緩沖液ph色譜柱DiamonsilTMC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相乙腈-四氫呋喃-磷酸二丁胺緩沖液(pH2.5±0.1)-水(115∶55∶25∶805,V/V);流速1.0mL/min;檢測波長287nm;進(jìn)樣量20μL。2.2.2替米考星脂質(zhì)體破乳效果分析分別取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、空白脂質(zhì)體破乳溶液(取空白脂質(zhì)體0.5mL置于50mL棕色容量瓶,加入甲醇溶解并稀釋至刻度)和替米考星脂質(zhì)體破乳溶液(取替米考星脂質(zhì)體0.5mL置于50mL棕色容量瓶,加入甲醇溶解并稀釋至刻度)各20μL進(jìn)樣分析,結(jié)果見圖1。由結(jié)果可見,替米考星反式異構(gòu)體和順式異構(gòu)體的色譜圖保留時間約為14.3min和17.2min,空白脂質(zhì)體只是在5.4min以前有色譜峰,表明輔料與試劑對替米考星的檢測沒有干擾。2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取替米考星對照品20.0mg,置100mL棕色容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,得濃度為200.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取儲備液0.25、1.25、2.50、6.25、12.50、20.00、25.00mL,分別置于50mL棕色容量瓶中,以PBS定容,得到濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、80.0、100μg/mL的溶液。按“2.2.1”項下色譜條件,取20μL不同濃度的對照品溶液分別注入液相色譜儀,記錄峰面積,以峰面積(A)積分值(順式+反式)為縱坐標(biāo),對照品濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=1.38×104x+2.44×103(r=0.9999)。結(jié)果表明。替米考星檢測濃度在1.0～100.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。2.2.4方法的精密度試驗分別移取1.0、25.0、100.0μg/mL低、中、高三個濃度的替米考星對照品溶液20μL,按“2.2.1”項下色譜條件,于1天內(nèi)和5天內(nèi)重復(fù)測定5次,記錄峰面積,計算日內(nèi)和日間精密度。測得日內(nèi)RSD分別為0.18%、0.26%和0.46%(n=5),日間RSD分別為0.47%、0.36%和0.69%(n=5),表明精密度良好。2.2.5進(jìn)樣通析條件分別精密移取1.0、50.0、100.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液20μL,按“2.2.1”項下色譜條件在0、2、4、8、12h進(jìn)樣,記錄峰面積。結(jié)果RSD分別為1.27%、0.78%、0.65%(n=5),表明方法重現(xiàn)性良好。2.3包封率的測定2.3.1洗脫曲線的測定分離脂質(zhì)體與游離替米考星采用葡聚糖凝膠G50柱(1cm×21cm)分離替米考星脂質(zhì)體與游離的替米考星。洗脫液為pH7.4的PBS,室溫下層析。精密移取替米考星脂質(zhì)體0.5mL上柱,以pH7.4的PBS為流動相洗脫,流速為1mL/min。收集洗脫液,每份1mL,共25份。洗脫曲線分別用甲醇定容至5mL搖勻,過微孔濾膜后按照“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出藥物的濃度,以洗脫體積為橫坐標(biāo),替米考星藥物濃度為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線,結(jié)果見圖2。洗脫曲線表明:前10mL洗脫液為含藥脂質(zhì)體,后15mL洗脫液為游離藥物,脂質(zhì)體和游離藥物通過葡聚糖凝膠G50柱可以很好地分離。2.3.2回收率的測定精密移取濃度為0.05、0.15、0.25mg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL上柱,按“2.3.1”項下條件進(jìn)行柱層析,收集游離藥物至25mL棕色容量瓶中,用甲醇定容,取20μL進(jìn)HPLC分析,記錄峰面積,計算替米考星柱回收率,其平均值為99.97%。精密移取濃度為0.05、0.15、0.25mg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別與空白脂質(zhì)體混合,得標(biāo)準(zhǔn)混合液,移取0.5mL上柱,相同條件下進(jìn)行柱層析,測定游離藥物的峰面積,計算柱加樣回收率,其平均值為99.46%。2.3.3替米考星游離藥物及總藥物量的測定精密吸取替米考星脂質(zhì)體溶液0.5mL,上柱,按“2.3.1”項下條件進(jìn)行柱層析,收集游離藥物至25mL棕色容量瓶中,甲醇定容至刻度,取20μL進(jìn)HPLC分析,記錄峰面積,計算替米考星游離藥物量。另取替米考星脂質(zhì)體溶液0.5mL至25mL棕色容量瓶中,直接用甲醇定容至刻度,取20μL進(jìn)HPLC分析,記錄峰面積,計算總藥物量。按照公式包封率=(W總-W游)/W總×100%計算脂質(zhì)體的包封率,其中W總為總藥物量,W游為未包入脂質(zhì)體的游離藥物量。結(jié)果3批替米考星脂質(zhì)體的包封率分別為98.63%、95.45%、96.70%,平均包封率為96.93%,RSD為1.65%。2.3.4對照品溶液的制備精密量取替米考星脂質(zhì)體0.5mL(相當(dāng)于替米考星1.5mg),置于50mL棕色容量瓶中,加甲醇破乳并定容,作為供試液,進(jìn)樣測定。另取濃度為30μg/mL的替米考星對照品溶液同法測定。按外標(biāo)法計算供試品中替米考星的含量。結(jié)果顯示,由優(yōu)化處方制得的3批脂質(zhì)體中替米考星的平均含量為97.3%。2.4替米考星的測定將按優(yōu)化處方制得的替米考星脂質(zhì)體充氮氣密封,于4℃放置3個月,觀察產(chǎn)品外觀并分別在1、2、3月取樣,透析法除去游離的替米考星,按“2.3.4”項下方法測定制劑中替米考星的含量,并按公式P=(C0-C)/C0×100%計算貯存過程中藥物的滲漏率P,其中C0、C分別為新鮮制備時和貯存一定時間后替米考星的含量。結(jié)果表明,樣品放置3個月后,仍為乳白色均勻混懸液,未發(fā)現(xiàn)沉淀。藥物滲漏率小于5%,表明該制劑在上述試驗條件下穩(wěn)定。2.5透射電子顯微鏡觀察取按優(yōu)化處方制得的替米考星脂質(zhì)體混懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù),滴到銅網(wǎng)上,用1%磷鎢酸溶液負(fù)染,干燥后用透射電子顯微鏡觀察。結(jié)果見圖3。由圖可見替米考星脂質(zhì)體為粒徑均勻的球狀或近球狀小囊泡。2.6粒徑分布及粒徑檢測取按優(yōu)化處方制得的替米考星脂質(zhì)體混懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù),取1.0mL,用激光衍射粒度分析儀測定平均粒徑及粒徑分布(各樣品測定10次,取均值),并進(jìn)行評分。結(jié)果表明,脂質(zhì)體粒徑分布較均勻,93.9%以上粒徑小于200nm,在59nm附近基本成正態(tài)分布,平均粒徑為(112.3±5.8)nm,符合預(yù)期要求。2.7zeta電位測定取按優(yōu)化處方制得的替米考星脂質(zhì)體混懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù),取1.0mL,用表面電位儀測定Zeta電位。結(jié)果表明,替米考星脂質(zhì)體的平均Zeta電位為+9.9mV。2.8藥物累積釋放率測定定量移取替米考星混懸液及替米考星脂質(zhì)體溶液各1.0mL溶液于透析袋(MWCO=12000)中,并將透析袋置于20mL的釋放介質(zhì)pH7.4的PBS中,在37℃,100r/min條件下進(jìn)行體外釋放實驗。于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、128、176、192h取樣20mL,同時補加等溫的相同體積的空白介質(zhì)。樣品經(jīng)0.45μm濾膜濾過,287nm處測定含量。按下式計算樣品的累積釋放率,并對時間作圖。藥物累積釋放曲線詳見圖4。累積釋放率=[V×(C1+C2+…+Ci)]/(V0×C0)×100%,其中V為每個時間點的取樣量,C1～Ci為每個時間點測得的替米考星的濃度,V0為加入透析袋中的替米考星脂質(zhì)體的體積(1mL),C0為加入透析袋中的替米考星脂質(zhì)體的濃度。由圖4可以看出,作為對照的替米考星溶液在8h就已釋放完全,替米考星脂質(zhì)體中的藥物在200h釋放完全。說明替米考星脂質(zhì)體中的藥物釋放具有明顯的緩釋作用。分別對替米考星脂質(zhì)體的體外釋藥數(shù)據(jù)按零級、一級和Higuchi方程擬合,擬合結(jié)果和相關(guān)系數(shù)詳見表1。由表1可知,相關(guān)系數(shù)r(0.98894)>r(0.98706)>r(0.97113),替米考星脂質(zhì)體的體外釋藥最符合一級動力學(xué)方程。3脂質(zhì)體的分離和純化在試驗中為了比較不同溶劑對替米考星的最大吸收峰的影響,測定了替米考星以蒸餾水、pH7.4的PBS、乙腈、乙腈-水、甲醇、甲醇-水作為溶劑的最大吸收峰,雖然吸收波長有所平移,但替米考星在最大吸收波長處的吸光度值基本不變。故溶劑對結(jié)果測定無顯著影響。在制備含藥脂質(zhì)體時,根據(jù)藥物裝載的機制不同,可分為被動載藥法與主動載藥法兩大類。由于采用主動載藥法制備脂質(zhì)體的包封率高、滲漏小,非常適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。故本實驗采用主動載藥法制備脂質(zhì)體。分離含藥脂質(zhì)體和游離藥物的常用方法有超速離心法、透析凝膠柱層析法、透析法等。離心法需使用冷凍高速離心機,而且不能排除在20000r/min以上長時間離心的條件下,部分含藥脂質(zhì)體會被破壞,導(dǎo)致藥物滲漏的可能。本研究制備的脂質(zhì)體粒徑較小,預(yù)實驗表明20000r/min的轉(zhuǎn)速分離效果不理想。透析法操作簡單,但耗時較長,且不排除藥物在透析過程中降解的可能性。脂質(zhì)體包封率測定的關(guān)鍵是使包封藥物和游離藥物得到很好地分離,本研究采用Sephadex-G50分離脂質(zhì)體和游替米考星,分離效果好,