土壤中總dna提取與純化研究

土壤中總dna提取與純化研究

從自然環(huán)境中提取細(xì)菌dna是一種非常有用的方法。它可以用來檢測(cè)不可培養(yǎng)的細(xì)菌，并跟蹤一些目標(biāo)菌株和重組基因的自然環(huán)境行為。也可以用來揭示土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從環(huán)境樣品中抽提和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)問題之一。來自環(huán)境中的樣品含有非常復(fù)雜的成分,尤其是土壤中的腐質(zhì)酸類物質(zhì)在提取過程中不能去除掉,直接影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增、雜交、內(nèi)切酶消化等。本文建立了適合從不同土壤提取總DNA并進(jìn)行純化的方法,可應(yīng)用于環(huán)境中微生物的研究。1材料和方法1.1土壤樣品的采集和性質(zhì)試驗(yàn)從各地采集了不同性質(zhì)的土壤,基本性質(zhì)如表1。1.2枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌大腸桿菌E.coliDH5α,霉?fàn)钛挎邨U菌(Bacillusmycoides),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)都是本實(shí)驗(yàn)室保存;鄰單胞菌(Plesiomonassp.)M6為本實(shí)驗(yàn)室分離的甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥降解菌(帶有甲基對(duì)硫磷水解酶基因mpd)。1.3土壤中氮提取方法1.3.1sds-k的提取稱取5g土壤樣品,與13.5mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,100mmol/L磷酸鈉,1.5mol/LNaCl,1%CTAB,pH8.0)混合,再加入100μL蛋白酶K(10mg/mL),于225r/min搖床上37℃搖動(dòng)30min,接著加入1.5mL20%SDS,65℃水浴2h,每隔15～20min輕輕顛倒幾下,室溫6000×g離心10min,收集上清,轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,土壤沉淀再加入4.5mL提取液和0.5mL20%的SDS,渦旋10s,65℃水浴10min,室溫6000×g離心10min,收集上清合并于上次上清。重復(fù)上述操作,收集上清與前兩次上清合并。上清與等體積的氯仿-異戊醇(24:1體積比)混合,離心,吸取水相轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管中,以0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀1h,室溫16000×g離心20min,收集核酸沉淀,用冷的70%乙醇洗滌沉淀,重懸于滅菌的無離子水中,最終體積為500μL。1.3.2土壤中dna的提取霉?fàn)钛挎邨U菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌過夜培養(yǎng),離心收集菌體,無菌水洗滌,再懸浮于等體積無菌水中。各吸取1mL上述3種懸浮液,分別加入5g滅菌土壤Y1中,搖床振蕩吸附30min后提取DNA。在此提取方法的基礎(chǔ)上,水浴結(jié)束后,于-70℃冷凍,然后于65℃融化,反復(fù)3次,比較兩種提取方法的效果。1.3.3提取dns的定量以λDNA(0.569μg/μL)作為標(biāo)準(zhǔn),與提取DNA同時(shí)電泳后,經(jīng)溴化乙錠染色后,用TANON凝膠分析軟件進(jìn)行分析定量。1.4土壤中的dna純度1.4.1純度方法透析袋電洗脫純化回收法,具體操作參見文獻(xiàn)1.4.2純化回收效率吸取20uL的標(biāo)準(zhǔn)λDNA(0.0569μg/μL),按上述回收方法回收DNA,回收DNA與標(biāo)準(zhǔn)λDNA同時(shí)電泳后用TANON軟件進(jìn)行定量,計(jì)算純化回收效率。1.5土壤中殘留生產(chǎn)力和質(zhì)量分析1.5.1土壤細(xì)菌dna提取9個(gè)土樣都于121℃濕熱滅菌1h,提取滅菌土壤的DNA檢查滅菌情況。E.coliDH5α隔夜培養(yǎng)后,離心收集菌體,無菌水洗滌3次,然后懸浮于等體積無菌水中,以無菌操作取1mL分別接種5g的9種滅菌土壤,搖床振蕩吸附0.5h后提取。同時(shí)設(shè)置純菌作為對(duì)照。所有處理與對(duì)照均有3個(gè)重復(fù)。提取后定量對(duì)照與各處理的DNA提取量,計(jì)算提取效率。提取效率=各處理的提取量/對(duì)照的提取量×100%。1.5.2pcr擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件從土壤DNA擴(kuò)增16SrDNA的引物1序列為:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.colibases8to27),引物2序列為:5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases1507to1492)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×緩沖液5μL,dNTP(25mmol/L)4μL,引物1(25pmol/μL)2μL,引物2(25pmol/μL)2μL,Mg2+(25mmol/L)4μL,模板(土壤DNA)10μL,TaqDNA聚合酶2.5U,ddH2O22.5μL,總體積50μL。反應(yīng)參數(shù):95℃變性10min;95℃2min,42℃30s,72℃4min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸20min。1.6土壤中目標(biāo)菌株dna提取靈敏度1.6.1土壤dna的提取菌株M6(帶有mpd基因)是甲基對(duì)硫磷降解菌,其甲基對(duì)硫磷水解酶基因已被克隆。菌株M6活化后,隔夜培養(yǎng),離心收集菌體,無菌水洗滌3次,以10-2-10-8系列稀釋,各稀釋度分別取1mL加入到5g土壤Y1中,搖床振搖30min,然后提取DNA進(jìn)行純化。提取前用含有甲基對(duì)硫磷的肉湯平板計(jì)數(shù)添加到土壤中的M6菌。1.6.2pc-pcr反應(yīng)體系及參數(shù)引物1為:5′-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3′,引物2為:5′-GAATTCTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×緩沖液2.5μL,dNTP(25mmol/L)2μL,引物1(25pmol/μL)0.5μL,引物2(25pmol/μL)0.5μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,模板(土壤DNA)3μL,TaqDNA聚合酶2.5U,ddH2O14.5μL總體積25μL。反應(yīng)參數(shù):95℃變性2min;95℃1min,45℃1min,72℃2min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。2結(jié)果和分析2.1土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌數(shù)、總dna提取量的關(guān)系用SDS高鹽抽提法從9種不同土壤中都提取出了DNA,而滅菌后的土壤,由于在高溫滅菌過程中核酸被分解,都不能提取到(圖1)。并且用該方法提出的總DNA,其片段均大于23.1kb,有利于對(duì)其進(jìn)行后續(xù)操作。每g干土中提取的DNA從3.30μg-13.41μg,提取量最大的是土壤Y1,最低的是土壤Y9。土壤中總DNA的提取量與土壤的有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)(r=0.91)。在同一種土壤中,例如紅壤,由于耕作措施的不同,使土壤有機(jī)質(zhì)含量也變化很大,土壤Y9由于不用有機(jī)肥料,土壤有機(jī)質(zhì)含量非常低,僅為0.99%,而增施秸桿和有機(jī)肥的土壤土壤有機(jī)質(zhì)明顯升高,土壤中可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)和總DNA提取量均相應(yīng)地發(fā)生變化(表2)。由此也說明,SDS高鹽抽提法適合于從不同的土壤中抽提DNA。2.2種芽孢桿菌添加物理性的處理方法對(duì)dna的提取效果由于基于SDS的的高鹽提取法會(huì)對(duì)一些革蘭氏陽性細(xì)菌效果不好,本文增加物理性的處理方法,由圖2可以看出,經(jīng)過凍融處理后,3種芽孢桿菌均提取到了DNA,未經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌未提取到DNA,并且凍融處理也未對(duì)DNA造成大的剪切,提取的DNA片段還大于23.1kb。2.3不同類型土壤中樣品的提取效率各種土壤由于性質(zhì)不同,特別是土壤中粘粒的比例不同,土壤總DNA的提取效率也會(huì)有很大的差異,9種土壤總DNA的提取效率從93.45%～60.51%,最高的為Y4,提取效率達(dá)到93.45%,最小的為Y6,提取效率為60.51%,(表3)土壤Y4為黃沙壤,粘粒所占比例最小。從表3中還可以看出,同一類型的土壤,提取效率差別不大。土壤中的粘粒由于會(huì)造成微生物緊緊吸附于其上而無法分離,或由于其周圍的空間小而造成無法與菌體裂解液發(fā)生作用。所以DNA提取效率與土壤中粘粒的比例是呈負(fù)相關(guān)的。2.4干預(yù)d的純度2.4.1純化回收效率20μL的標(biāo)準(zhǔn)λDNA(0.0569μg/μL)經(jīng)透析袋回收后,得到0.7436±0.0702μgDNA,則純化回收效率為:0.7436/(20×0.0569)×100%=65.34%。透析袋回收法雖然操作復(fù)雜,但對(duì)于大片段DNA卻非常有效。2.4.2純化除雜劑由于從土壤中提取的DNA含有腐質(zhì)酸類物質(zhì)在提取過程中無法去除掉,若不經(jīng)過純化,則由于所含的腐質(zhì)酸等雜質(zhì)的干擾,使其不能用于下一步的操作,如PCR擴(kuò)增、雜交等。本文從純化后的土壤DNA中通過PCR直接擴(kuò)增出土壤細(xì)菌的16SrDNA(圖3),證明經(jīng)過該方法純化后的土壤DNA,適合進(jìn)行后續(xù)的操作。2.5pcr擴(kuò)增目的條帶使用一對(duì)特異引物擴(kuò)增M6菌株的mpd基因片段,大小為1.0kb左右。取3μL純化后的DNA做模板,可以從每g添加362個(gè)菌體的Y1土樣中擴(kuò)增出目的條帶(圖4)。而不添加M6菌株的土樣則不能擴(kuò)增出目的條帶。說明所建立的提取與純化方法對(duì)提取土壤中的目標(biāo)菌株是非常靈敏的。應(yīng)用該方法來分離土壤中含量少的微生物或基因資源,或者用來監(jiān)測(cè)自然環(huán)境中的特定菌株或重組基因也是行之有效的。3土壤中dna的提取由于土壤本身及其中微生物的復(fù)雜性,常規(guī)分析微生物的方法如平板計(jì)數(shù)、生物量測(cè)定等方法的準(zhǔn)確性受到了極大的限制。從土壤微生物群體基因組的角度研究其多樣性及功能是一種可行的方法,并已在國外受到廣泛的關(guān)注。從DNA的角度分析土壤微生物關(guān)鍵是DNA的提取。從土壤或沉積物中提取DNA的方法可以分為兩類,一是在土壤中直接裂解微生物體,再提取DNA。另一類是先將微生物菌體與土壤顆粒分開,再提取DNA。一般第一類方法提取效率比較高。從土壤中提取DNA有兩個(gè)關(guān)鍵步驟:①土壤中菌體細(xì)胞的裂解和粗DNA的提取;②粗DNA的純化。粗DNA的提取和純化均有不同的方法,有些工作者應(yīng)用物理方法破碎菌體,如超聲波破碎等,所得到的片段較小。也有用微型柱進(jìn)行粗提DNA的純化,但每次能純化的樣品少,對(duì)于大片段的DNA回收率低。選用哪種方法的組合,要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇基于SDS的高鹽提取法和透析袋回收法,既保證了一定的提取與回收效率,又兼顧了DNA的質(zhì)量,使在提取和純化過程中,DNA不會(huì)受到機(jī)械損傷。提取方法的效率及其靈敏度對(duì)于后續(xù)研究是十分重要的,高效提取才能具有代表性。基于SDS的高鹽提取法對(duì)9種土壤總DNA的提取效率從93.45%～60.51%,