hplc-msms法測(cè)定人血漿中色甘酸鈉的生物等效性

hplc-msms法測(cè)定人血漿中色甘酸鈉的生物等效性

彩加藍(lán)a是一種新型抗過敏劑，對(duì)快速生長(zhǎng)和過敏反應(yīng)有很好的抑制作用。臨床可用于預(yù)防各型哮喘的發(fā)作及過敏性眼部疾患、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)腸炎、消化道過敏等。色甘酸鈉呈強(qiáng)酸性,極性較高,口服僅1%從胃腸道吸收,主要經(jīng)鼻腔給藥。色甘酸鈉含量測(cè)定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、反相高效液相色譜法等,但由于給藥劑量小,血濃度低,這些常規(guī)檢測(cè)方法都無(wú)法滿足生物樣品微量色甘酸鈉測(cè)定的要求。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,進(jìn)行生物樣品中色甘酸鈉的測(cè)定,但其樣品處理方法復(fù)雜,操作繁瑣。本研究以普伐他汀鈉為內(nèi)標(biāo),采用HPLC-MS/MS法測(cè)定血漿中色甘酸鈉濃度,操作簡(jiǎn)便,分析周期短,定量限達(dá)0.3ng·mL-1,可用于色甘酸鈉鼻腔給藥的藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究。分組、給藥方案及儀器儀器與試劑Agilent6410TripleQuadLC-MS/MS,1200seriesHPLC,Hip-ALSSL進(jìn)樣器(美國(guó)安捷倫科學(xué)技術(shù)公司)。色甘酸鈉鼻用噴霧劑(試驗(yàn)制劑,T),山東京衛(wèi)制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào)S0704017。色甘酸鈉滴鼻液(參比制劑,R),沈陽(yáng)華益藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)20070301。色甘酸鈉對(duì)照品由山東京衛(wèi)制藥有限公司提供,純度99%。試驗(yàn)對(duì)象健康男性志愿者20名,體重(67.4±4.6)kg。于試驗(yàn)前統(tǒng)一體格檢查、肝、腎功能正常且無(wú)急、慢性疾病及家族遺傳病史。試驗(yàn)前2周內(nèi)無(wú)用藥史,3月內(nèi)未參加其他新藥臨床實(shí)驗(yàn),志愿者在試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期內(nèi)禁煙酒。試驗(yàn)前簽定書面知情同意書,試驗(yàn)方案通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試驗(yàn)方案單劑兩周期雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。20名健康志愿者隨機(jī)分為兩組并編號(hào)為1～20,試驗(yàn)當(dāng)日晨抽取空白血樣后,立即鼻腔給予色甘酸鈉鼻用噴霧劑(T)或色甘酸鈉滴鼻液(R),按照鼻腔給藥操作流程要求,噴口向上傾斜45度,每鼻孔兩噴。于用藥后0.17,0.33,0.5,0.67,0.83,1.0,1.25,1.5,2.0,3.0,4.0和5.0h取肘靜脈血4mL,肝素抗凝,5000r·min-1離心5min,取血漿置Ep管-20℃低溫保存。周期間清洗期為1周。第2周期用藥劑量、留樣方法同第1周期。色譜條件及質(zhì)譜條件色譜條件:AGTVenusilXBPC18(250mm×4.6mmID,5μm)色譜柱;流動(dòng)相為乙酸銨-甲醇(含50%乙腈)(15∶85),在線脫氣;流速0.4mL·min-1;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。質(zhì)譜條件:ESI離子源,正離子模式,霧化壓力280kPa,干燥氣(N2)流速10L·min-1,干燥氣溫度為350℃,毛細(xì)管電壓4kV,碰撞氣為氮?dú)?壓力小于0.2MPa。多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式,m/z469→263.1(色甘酸鈉),m/z447.2→327.1(內(nèi)標(biāo)),色甘酸鈉碰撞能量為20V,碎片電壓為150V,EMV=600;內(nèi)標(biāo)碰撞能量為20V,碎片電壓為100V,EMV=600。樣品溶液的配制色甘酸鈉對(duì)照品溶液的配制精密稱取色甘酸鈉對(duì)照品10.6mg,以水配成1mg·mL-1儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液100μL,用流動(dòng)相稀釋為10μg·mL-1儲(chǔ)備液I。取儲(chǔ)備液I,用流動(dòng)相依次稀釋得到1μg·mL-1儲(chǔ)備液II、100ng·mL-1儲(chǔ)備液III和10ng·mL-1儲(chǔ)備液IV,4℃冷藏備用。內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取普伐他汀鈉對(duì)照品12.5mg,用甲醇配成0.5mg·mL-1普伐他汀鈉溶液。用甲醇依次稀釋得50μg·mL-1儲(chǔ)備液I和250ng·mL-1的儲(chǔ)備液II,4℃冷藏備用。樣本處理取血漿樣品1mL,加入250ng·mL-1普伐他汀鈉內(nèi)標(biāo)溶液20μL,過WatersSep-pak小柱(1mLVacC18,用前經(jīng)甲醇2mL和水2mL活化),再用水1mL洗滌,棄去洗滌液。甲醇1mL洗脫,洗脫液于40℃水浴N2吹干,殘留物用流動(dòng)相100μL復(fù)溶,進(jìn)樣10μL。結(jié)果1方法論的特殊性對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖見圖1,空白血漿及志愿者血漿樣本色譜圖見圖2,表明血漿中內(nèi)源物質(zhì)無(wú)干擾。2空白血漿提取取空白人血漿適量置10mL試管中,分別配成含色甘酸鈉0.3,0.5,1,2,4,8,10和20ng·mL-1系列空白血漿溶液。按“樣本處理”項(xiàng)下提取,進(jìn)樣測(cè)定。以色甘酸鈉與普伐他汀鈉峰面積比(Y)為縱坐標(biāo),色甘酸鈉濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算色甘酸鈉回歸方程(n=8)為:Y=0.5114X+0.0011,r=0.9939。線性范圍為0.3～20ng·mL-1,定量限為0.3ng·mL-1。3回收率和精密度取低、中、高3個(gè)濃度(0.5,4和15ng·mL-1)的色甘酸鈉對(duì)照品血漿,按“樣本處理”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析。計(jì)算提取相對(duì)回收率和絕對(duì)回收率(n=5);一日內(nèi)測(cè)定5次,計(jì)算日內(nèi)變異;每日測(cè)定1次,連續(xù)測(cè)定5日計(jì)算日間變異。3個(gè)濃度的相對(duì)回收率分別為94.80%,101.80%和91.80%;絕對(duì)回收率分別為94.69%,94.11%和95.84%。3個(gè)濃度測(cè)定的日內(nèi)精密度分別為14.30%,3.93%和4.64%;日間精密度分別為9.99%,9.80%和4.70%。4凍融和貯存時(shí)間的影響分別取含色甘酸鈉低、中、高3個(gè)濃度(0.5、4和15ng·mL-1)的質(zhì)控樣品各5份,測(cè)定冷凍前、凍融1次、凍融2次、冷凍24h和冷凍7d時(shí)藥物的濃度,考察凍融和存放時(shí)間對(duì)色甘酸鈉穩(wěn)定性的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明色甘酸鈉在上述條件下穩(wěn)定,RSD%均小于12%。5鈉鼻和參比制劑為保證給藥劑量的準(zhǔn)確性,在給藥前進(jìn)行給藥劑量考察試驗(yàn),以確定給藥劑量。試驗(yàn)制劑色甘酸鈉鼻用噴霧劑規(guī)格0.26g/100噴/13mL(20mg·mL-1);參比制劑色甘酸鈉滴鼻液規(guī)格20mg·mL-1。按照實(shí)際鼻腔給藥操作流程要求噴口向上傾斜45度向Ep管中噴入藥物(每管兩噴),稱重,計(jì)算試驗(yàn)制劑與參比制劑的校正因子。結(jié)果見表1。6質(zhì)控樣品的檢測(cè)在未知樣品測(cè)定過程中,隨行測(cè)定低、中、高濃度(0.5,4和15ng·mL-1)的質(zhì)控樣品,使其均勻分布在未知樣品測(cè)試順序中,以考察分析方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果3個(gè)濃度QC樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12%,符合體內(nèi)藥物分析的要求。7血液中藥物的濃度20名志愿者鼻腔給予色甘酸鈉試驗(yàn)制劑和參比制劑后,血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。8藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)將單劑給藥色甘酸鈉后的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用DAS2.0軟件處理進(jìn)行擬合,結(jié)果表明其在人體內(nèi)代謝過程基本符合二室模型,其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2?；厥章省⒕芏扰c生物利用度色甘酸鈉臨床應(yīng)用劑量小,人體血藥濃度低,常規(guī)檢測(cè)方法都無(wú)法滿足生物樣品中微量藥物測(cè)定的要求。本研究操作簡(jiǎn)便,靈敏度和準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,經(jīng)方法學(xué)考察確證其回收率和日內(nèi)、日間精密度均符合生物樣品