氨基糖苷類藥物中鈍化酶的研究進(jìn)展

氨基糖苷類藥物中鈍化酶的研究進(jìn)展

1細(xì)菌耐藥性分析氨基糖苷類抗生素是通過(guò)二或三氨基糖分子和非糖部分的化合物而成的。這是一種常見(jiàn)的抗生素。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌逐漸產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥。其耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,主要包括細(xì)胞內(nèi)外電位差的改變、細(xì)菌的主動(dòng)外排、靶位點(diǎn)的改變及鈍化酶的產(chǎn)生。臨床上氨基糖苷類耐藥的主要機(jī)制是鈍化酶的產(chǎn)生,即抗生素的氨基或羥基被酶修飾后與核糖體結(jié)合不緊密而不能進(jìn)入下一階段發(fā)揮抗菌作用,使細(xì)菌在抗生素存在的情況下仍能存活。在細(xì)菌胞漿內(nèi)對(duì)抗生素進(jìn)行修飾的鈍化酶主要有三類:氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosidephosphotransferases,APH)、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosideacetyltransferases,AAC)和氨基糖苷類核苷轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosidenucleotidyltransferases,ANT)。不同細(xì)菌和不同菌株的耐藥性相差很大,影響因素包括酶量、催化效率及用藥量。依據(jù)修飾位點(diǎn)的不同,每種酶又分為多種同工酶及其亞型,各亞型有不同的耐藥表型,相同的表型還可由不同的基因編碼。2一般氨基糖苷類化合酶2.1aph-b基因編碼的耐藥基因APH是一種利用ATP作為第二底物,且能磷酸化所有氨基糖苷類抗生素的羥基酶。目前,臨床上分離到7種APH,即APH(3′)、APH(2″)、APH(3″)、APH(4)、APH(7″)、APH(6)和APH(9)。2.1.1APH(3′)多數(shù)APH在3′位修飾羥基,現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種不同的APH(3′),即APH(3′)-Ⅰ~APH(3′)-Ⅶ,磷酸化產(chǎn)物缺乏抗生素活性。APH(3′)-Ⅰ產(chǎn)生對(duì)卡那霉素、新霉素、核糖霉素等的抗藥性。首先在大腸埃希菌的Tn903轉(zhuǎn)座子上發(fā)現(xiàn)其編碼基因aph(3′)-Ⅰ,后來(lái)又在肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌、霍亂弧菌和空腸彎曲桿菌等G-菌中發(fā)現(xiàn)。近來(lái)又在G+條件致病菌棒狀桿菌中發(fā)現(xiàn)。APH(3′)-Ⅱ與APH(3′)-Ⅰ具有相似的耐藥譜,臨床上卻少見(jiàn)。只是在銅綠假單胞菌的染色體上發(fā)現(xiàn)APH(3′)-Ⅱb的編碼基因。APH(3′)-Ⅱb與APH(3′)-Ⅱa有52%的氨基酸相同,同源性達(dá)67%。Zeng等發(fā)現(xiàn)aph(3′)-Ⅱb的表達(dá)受到HpaA的調(diào)控,認(rèn)為其表達(dá)產(chǎn)物是一種與氨基糖苷類有交叉反應(yīng)性的代謝酶。APH(3′)-Ⅲ磷酸轉(zhuǎn)移酶首先從金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌中找到,接著又在結(jié)腸彎曲桿菌中檢出,其編碼基因?yàn)閍ph(3′)-Ⅲ,該基因可在G+和G-菌間轉(zhuǎn)移。APH(3′)-Ⅲ產(chǎn)生對(duì)卡那霉素、新霉素、核糖霉素和阿米卡星等的耐藥。盡管此酶對(duì)阿米卡星產(chǎn)生中度耐藥,但發(fā)現(xiàn)它對(duì)阿米卡星-氨芐西林聯(lián)合用藥也耐藥。APH(3′)-Ⅳ和APH(3′)-Ⅴ僅在抗生素的微生物中發(fā)現(xiàn)。APH(3′)-Ⅵ對(duì)阿米卡星、卡那霉素、新霉素、核糖霉素等耐藥,其編碼基因主要在不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)。早期對(duì)氨基糖苷類的耐藥基因的研究結(jié)果表明,對(duì)阿米卡星耐藥的不動(dòng)桿菌中83%~95%有aph(3′)-Ⅵa,后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)只有46%。APH(3′)-Ⅶ產(chǎn)生對(duì)卡那霉素和新霉素的耐藥,其編碼基因在空腸彎曲桿菌中找到,但是其基因分布還未研究清楚。2.1.2APH(2″)在G+菌中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)編碼APH(2″)的基因。位于aac(6′)-Ⅰe下游aph(2″)-Ⅰa基因編碼的雙功能酶(AAC(6′)-Ⅰe-APH(2″)-Ⅰa)C末端部分。在腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的乙酰轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性使它們對(duì)臨床上除鏈霉素外的所有氨基糖苷類抗生素耐藥。另三個(gè)酶APH(2″)-Ⅰb,APH(2″)-Ⅰc和APH(2″)-Ⅰd最近在腸球菌中發(fā)現(xiàn)。APH(2″)-Ⅰc產(chǎn)生對(duì)慶大霉素、妥布霉素和卡那霉素的中度耐藥,而APH(2″)-Ⅰb和APH(2″)-Ⅰd產(chǎn)生對(duì)這些抗生素的重度耐藥,且對(duì)奈替米星和地貝卡星(dibekacin)耐藥。盡管APH(2″)-Ⅰb,APH(2″)-Ⅰc和APH(2″)-Ⅰd不如雙功能酶那樣常見(jiàn),但它們可消除慶大霉素和作用于細(xì)胞壁的藥物如氨芐西林、萬(wàn)古霉素的協(xié)同作用。2.1.3APH(3″)和APH(6)APH(3″)和APH(6)分別修飾鏈霉素的3″-和6-羥基。編碼APH(3″)-Ⅰ有兩個(gè)基因,aph(3″)-Ⅰa見(jiàn)于鏈霉素的鏈霉菌,aph(3″)-Ⅰb從G-菌的質(zhì)粒RSF1010中找到。盡管這兩種酶在不同的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn),它們有50%的氨基酸相同、68%同源性。已發(fā)現(xiàn)4個(gè)在6位磷酸化鏈霉素的酶,編碼APH(6)-Ⅰa和APH(6)-Ⅰb的基因在鏈霉素的鏈霉菌中發(fā)現(xiàn),APH(6)-Ⅰc常在G-菌中見(jiàn)到。編碼APH(6)-Ⅰd的基因也從質(zhì)粒RSF1010中找到,而此質(zhì)粒也存在于APH(3″)-Ⅰb。聯(lián)合基因aph(3″)-Ⅰb-aph(6)-Ⅰd在植物和動(dòng)物的病原菌中都可見(jiàn)到,植物中主要與大結(jié)合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子相關(guān),見(jiàn)于解淀粉歐文菌、草生歐文菌和野生黃桿菌。人和動(dòng)物的病原上的aph(3″)-Ⅰb-aph(6)-Ⅰd聯(lián)合基因與G-菌的小非結(jié)合質(zhì)粒相聯(lián)系。2.1.4其他APH(4)和APH(7″)產(chǎn)生對(duì)潮霉素的耐藥性,APH(9)產(chǎn)生對(duì)大觀霉素的耐藥性,這幾種酶在臨床上并不多。各種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用底物見(jiàn)表1。2.2結(jié)構(gòu)的完整性AAC有4種同工酶:AAC(1)、AAC(3)、AAC(2′)和AAC(6′)。它們主要以乙酰輔酶A作為乙?；墓w,分別作用于氨基糖苷類抗生素的2-脫氧鏈霉胺環(huán)的1位和3位、6-氨基己糖環(huán)的2′位和6′位。2.2.1AAC(6′)AAC(6′)為寬譜酶,它能修飾臨床上多數(shù)氨基糖苷類抗生素。AAC(6′)-Ⅰ對(duì)阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、異帕米星、地貝卡星和西索米星的耐藥,已在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)該酶的24種亞型。已知的AAC(6′)中AAC(6′)-Ⅰb是G-菌中最常見(jiàn)的,臨床上約70%的G-菌有此活性。編碼AAC(6′)-Ⅰb的基因已在細(xì)菌染色體的轉(zhuǎn)座子和整合子中發(fā)現(xiàn),據(jù)推測(cè)許多微生物的選擇性抗生素抵抗是由編碼該酶的基因位點(diǎn)變化所致。用DNA雜交已在G-菌染色體中發(fā)現(xiàn)了一些編碼基因,如aac(6′)-Ⅰk,aac(6′)-Ⅰf,aac(6′)-Ⅰc,aac(6′)-Ⅰz。AAC(6′)-Ⅰe是雙功能酶AAC(6′)-Ⅰe-APH(2″)-Ⅰa的N端部分。此雙功能酶的基因廣泛存在于G+菌的轉(zhuǎn)座子Tn4001上。兩個(gè)功能區(qū)結(jié)構(gòu)相連,卻不相互加強(qiáng)抵抗活性。然而,Boehr等的研究發(fā)現(xiàn),破壞其結(jié)構(gòu)的完整性,可以明顯抑制各自的活性。另外還發(fā)現(xiàn)渥曼青霉素(wortmannin)可以通過(guò)與ATP結(jié)合槽中的賴氨酸結(jié)合而不可逆地滅活A(yù)AC(6′)-APH(2″),但不能滅活A(yù)PH(3′)-Ⅲa。對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的研究發(fā)現(xiàn)5′端臨近區(qū)的12bp缺失導(dǎo)致該雙功能酶的過(guò)度表達(dá)。AAC(6′)-Ⅰi是GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶(GNAT)超家族成員之一,廣泛分布于糞鏈球菌,從而使其對(duì)妥布霉素、西索米星、奈替米星、卡那霉素耐藥。AAC(6′)-Ⅰm在糞鏈球菌和大腸埃希菌中見(jiàn)到,其基因的DNA序列與aac(6′)-Ⅰe有65%同源性,位于aph(2″)-Ⅰb附近。Asp-99作為活性位點(diǎn)在AAC(6′)-Ⅰe的功能中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)證明aac(6′)-Ⅰm見(jiàn)于腸球菌和大腸埃希菌中,還見(jiàn)于假單胞菌、克雷伯桿菌、檸檬酸桿菌、沙雷菌和氣單胞菌等G-菌,其耐藥基因可以在G+和G-菌中轉(zhuǎn)移。AAC(6′)-Ⅱ只發(fā)現(xiàn)了兩種,它們產(chǎn)生對(duì)慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、西索米星的耐藥,但不產(chǎn)生對(duì)阿米卡星的耐藥。AAC(6′)-Ⅱa和AAC(6′)-Ⅱb首先在銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌中發(fā)現(xiàn),它們對(duì)慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星和西索米星耐藥。2.2.2AAC(3)AAC(3)-Ⅰ為窄譜酶,其修飾底物包括慶大霉素、西索米星和阿司米星(astromicin,Fortimicin)。AAC(3)-Ⅰa和AAC(3)-Ⅰb的編碼基因見(jiàn)于臨床上30%的G-菌。aac(3)-Ⅰa見(jiàn)于結(jié)合質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和腸球菌、銅綠假單胞菌整合子的基因盒。近來(lái)又發(fā)現(xiàn)aac(3)-Ⅰb與另一個(gè)位于銅綠假單胞菌整合子的耐藥基因aac(6′)-Ⅰb融合。編碼AAC(3)-Ⅱa,AAC(3)-Ⅱb和AAC(3)-Ⅱc的三個(gè)aac(3)-Ⅱ基因也已找到,它們的同源性較高。AAC(3)-Ⅱ引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星和西索米星耐藥。研究發(fā)現(xiàn)85%的細(xì)菌有AAC(3)-Ⅱa表型,6%有AAC(3)-Ⅱb表型。AAC(3)-Ⅲ,AAC(3)-Ⅳ和AAC(3)-Ⅵ不常見(jiàn)。AAC(3)-Ⅲa,AAC(3)-Ⅲb和AAC(3)-Ⅲc引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素、西索米星、卡那霉素、新霉素、利維霉素(lividomycin)、巴龍霉素、地貝卡星耐藥。AAC(3)-Ⅳ引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、安普霉素(apramycin)、地貝卡星和西索米星耐藥。AAC(3)-Ⅵ引起對(duì)慶大霉素的耐藥性較少見(jiàn),其編碼基因從陰溝腸桿菌的結(jié)合質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)。2.2.3AAC(1)在大腸埃希菌中AAC(1)產(chǎn)生對(duì)安普霉素、利維霉素、巴龍霉素和核糖霉素耐藥。由于這些抗生素未在臨床上廣泛應(yīng)用,對(duì)該酶的研究不多,其基因也尚未被克隆。2.2.4AAC(2′)AAC(2′)-Ⅰa的基因分離自司徒普羅威登斯菌(Providenciastuartii),此酶或與其他酶一起成為司徒普羅威登斯菌對(duì)慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、地貝卡星和新霉素耐藥的主要機(jī)制。突變株aac(2″)-Ⅰa的mRNA水平升高,產(chǎn)生高度的耐藥。研究發(fā)現(xiàn)AAC(2′)-Ⅰa的調(diào)節(jié)過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜,包括至少7個(gè)調(diào)節(jié)基因,通過(guò)兩種途徑進(jìn)行。AAC(2′)-Ⅰb,-Ⅰc,-Ⅰd,-Ⅰe在分支桿菌中找到,對(duì)來(lái)自結(jié)核分支桿菌的AAC(2′)-Ⅰc研究發(fā)現(xiàn),它既可對(duì)抗生素進(jìn)行N-乙?；部蛇M(jìn)行O-乙?；Ｅc來(lái)自司徒普羅威登斯菌的AAC(2′)-Ⅰa不同,來(lái)自分支桿菌的AAC(2′)-Ⅰ不產(chǎn)生明顯的氨基糖苷類耐藥,有關(guān)其功能尚不清楚。各類氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用底物見(jiàn)表1。2.3ant2-a的耐藥ANT已發(fā)現(xiàn)5種同工酶:ANT(2″),ANT(3″),ANT(4′),ANT(6),ANT(9)。其作用機(jī)制是利用ATP作為第二底物,通過(guò)將AMP分別轉(zhuǎn)移到2″,3″,4′,6,9位的羥基上而修飾氨基糖苷類抗生素。ANT(2″)-Ⅰa引起對(duì)慶大霉素、妥布霉素、西索米星、卡那霉素、達(dá)佐霉素的耐藥。ant(2″)-Ⅰa基因主要分布在小非結(jié)合質(zhì)粒、結(jié)合質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等上。ANT(3″)-Ⅰ主要修飾鏈霉素的3″位羥基、壯觀霉素的9位羥基而產(chǎn)生耐藥性,已發(fā)現(xiàn)了至少8個(gè)相應(yīng)編碼基因,廣泛見(jiàn)于G-菌及G+菌中的金黃色葡萄球菌和棒狀桿菌。ANT(4′)主要有兩個(gè)亞型。ANT(4′)-Ⅰa引起對(duì)阿米卡星、妥布霉素、達(dá)佐霉素、卡那霉素、異帕米星耐藥。已在金黃色葡萄球菌、嗜熱桿菌和腸球菌中發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)編碼基因。與ANT(4′)-Ⅰ不同,ANT(4′)-Ⅱa僅在包括腸桿菌和假單胞菌的G-菌中見(jiàn)到,它對(duì)阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、異帕米星耐藥。ANT(6)-Ⅰ引起對(duì)鏈霉素的耐藥性,在歐洲,用DNA雜交法在80%腸桿菌和葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了其編碼基因,同時(shí)它們大都還產(chǎn)生其他氨基糖苷類鈍化酶,而使