pcr-sscp檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌kag、rfp、sm的基因表達(dá)

pcr-sscp檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌kag、rfp、sm的基因表達(dá)

抗多醇腦?。╩dr-t）的出現(xiàn)是當(dāng)前淋巴結(jié)快速擴(kuò)張和治療的困難的一個(gè)重要原因。到目前為止，尚不完全清楚耐多醇控制帶桿菌的藥物特性。多數(shù)學(xué)者研究證明，結(jié)核菌的耐藥機(jī)制與其體內(nèi)存在某些耐藥基因或缺乏某些基因有關(guān)。本文就聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP）與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和BACTEC細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)耐多藥結(jié)核菌的實(shí)際結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。1材料和方法1.1材料表面菌株來源：22株耐多藥結(jié)核菌為我院臨檢室常規(guī)培養(yǎng)分離株，8株耐多藥結(jié)核菌為深圳市東湖醫(yī)院BACTEC培養(yǎng)分離株。1.2方法1.2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果用改良羅氏法培養(yǎng)，對(duì)異煙肼（H）、利福平（R）、鏈霉素（S）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，H、R、S三種藥物的高濃度耐藥標(biāo)準(zhǔn)分別為10、250、100μg/ml，低濃度耐藥標(biāo)準(zhǔn)分別為1、50、10μg/ml。1.2.2bactec培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基，C14同位素測(cè)定結(jié)核菌代謝產(chǎn)物判斷生長(zhǎng)情況。H、R、S三種藥物的耐藥標(biāo)準(zhǔn)同常規(guī)培養(yǎng)。1.2.3加溶菌酶取耐多藥結(jié)核分枝桿菌分離株少許，加入DTT80℃30min，加溶菌酶37℃2h，蛋白酶K,65℃2h。離心后上清液+無水乙醇+醋酸鈉-20℃保存?zhèn)錂z。1.2.4ccca機(jī)構(gòu)及其衍生物的合成試劑由中國(guó)人民解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究室提供。引物序列為KatG:5′-GCGATCACATCCGTGATCACA-3′，5′-GTCAGGGCGTCAAGTCGACTG-3′；rpoB:5′-CGGATGACCACCCAGGC-3′，5′-GGTTTCGATCGGGCAAAT-3′；rpsL:5′-CCCACCATTCAGCGCAGCTGGT-3′，5′-GTCGAGCGAACCGCGAATGA-3′。采用25μl反應(yīng)體系，94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸1min共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。每次擴(kuò)增均設(shè)陽性和陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外線檢測(cè)呈280bp(KatG）、285bp(rpoB）、267bp(rpsL）條帶。1.2.5酶活劑配制8%非變性聚丙烯酰膠凝膠，待凝膠聚合后預(yù)電泳30min,5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積甲酰胺變性液混勻，95℃變性10min，樣品加入凝膠孔中在0℃130～150V電泳4～5h后取凝膠板行銀染法染色，觀察結(jié)果并與標(biāo)準(zhǔn)株H37RV對(duì)比。2結(jié)果2.12rp因子檢測(cè)在12株H高耐藥株中檢出KatG基因10株，13株R高耐藥株中檢出rpoB基因12株，12株S高耐藥株中檢出rpsL基因8株；在10株H低耐藥株中檢出KatG基因6株，9株R低耐藥株中檢出rpoB基因7株，10株S低耐藥株中檢出rpsL基因6株。2.28bactec、rp生物基因檢測(cè)結(jié)果在4株H高耐藥株中檢出KatG基因3株，5株R高耐藥株中檢出rpoB基因4株，4株S高耐藥株中檢出rpsL基因3株；在4株H低耐藥株中檢出KatG基因2株，3株R低耐藥株中檢出rpoB基因2株，4株S低耐藥株中檢出rpsL基因2株。綜合以上結(jié)果，KatG基因常規(guī)培養(yǎng)檢出率在H高耐藥分離株為83.3%(10/12),H低耐藥分離株為60.0%(6/10);BACTEC培養(yǎng)檢出率在H高耐藥分離株為75.0%(3/4),H低耐藥分離株為50.0%(2/4），兩者合并KatG基因檢出率為70.0%(21/30）。rpoB基因常規(guī)培養(yǎng)檢出率在R高耐藥分離株為92.3%(12/13),R低耐藥分離株為77.7%(7/9);BACTEC培養(yǎng)檢出率在R高耐藥分離株為80.0%(4/5),R低耐藥分離株為66.6%(2/3），兩者合并rpoB基因檢出率為83.3%(25/30）。rpsL基因常規(guī)培養(yǎng)檢出率在S高耐藥分離株為66.6%(8/12),S低耐藥分離株為60.0%(6/10);BACTEC培養(yǎng)檢出率在S高耐藥分離株為75.0%(3/4),S低耐藥分離株為50.0%(2/4），兩者合并rpsL基因檢出率為63.3%(19/30）。耐多藥結(jié)核分枝桿菌KatG、rpoB、rpsL基因突變與結(jié)核分枝桿菌H37RV對(duì)比的PCR-SSCP電泳圖譜見圖1。3pacte檢測(cè)結(jié)果現(xiàn)已證明結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH、RFP、SM的耐藥性分別與KatG、rpoB、rpsL基因突變有關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH的耐藥性47%～58%與KatG突變有關(guān)，對(duì)RFP的耐藥性96%～98%與rpoB基因突變有關(guān)，對(duì)SM的耐藥性52%～59%與rpsL基因突變有關(guān)。在本文的檢測(cè)結(jié)果中顯示，22株常規(guī)培養(yǎng)檢出的耐INH、RFP、SM結(jié)核分枝桿菌分離株KatG、rpoB、rpsL基因檢出率分別為72.7%(16/22）、86.4%(19/22）、63.6%(14/22），與結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV電泳條帶對(duì)比特異性為100%，敏感性為97%。8株BACTEC培養(yǎng)檢出的耐INH、RFP、SM結(jié)核分枝桿菌分離株KatG、rpoB、rpsL基因檢出率分別為62.5%(5/8）、75.0%(6/8）、62.5%(5/8），與結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV電泳條帶對(duì)比特異性為100%，敏感性96%。本文檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似。高濃度耐藥與低濃度耐藥分離株的KatG、rpoB及rpsL基因檢出率有顯著差異（P<0.05），提示高濃度耐藥分離株中的檢出率