一株嗜熱糖苷酶的克隆、表達及純化

III加入到混合液中；在4

℃的條件下12000

r/min離心5min，取離心后的上清液；向上清液中加入等量的酚/氯仿混勻，將混合物在4

℃的條件下12000r/min離心2min，取上清液至另一離心管中；加入冰乙醇振蕩，混合均勻放置于-20

℃的條件約1h；在4℃的條件下13000r/min離心5min；小心取出離心管，迅速倒掉上清液，并將離心管立刻倒置于濾紙上，使離心管內(nèi)液體盡量流凈；用75%的乙醇洗滌所剩的微量沉淀，烤干；用20μL雙蒸水重懸沉淀，于-20℃條件下保存ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>熊福銀</Author><Year>2009</Year><RecNum>15</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[30]</style></DisplayText><record><rec-number>15</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5zxswp9dftpsetesffnx5e5gx9dt0zxxa2ad"timestamp="1559617130">15</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>熊福銀</author><author>林艷麗</author><author>吳曉潔</author><author>周艷榮</author><author>鄧繼先</author><author>陳紅星</author></authors></contributors><auth-address>軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所;</auth-address><titles><title>一種快速、有效、經(jīng)濟的提取酵母質(zhì)粒的方法</title><secondary-title>生物技術通訊</secondary-title></titles><periodical><full-title>生物技術通訊</full-title></periodical><pages>386-387</pages><volume>20</volume><number>03</number><keywords><keyword>酵母質(zhì)粒</keyword><keyword>酶消化法</keyword></keywords><dates><year>2009</year></dates><isbn>1009-0002</isbn><call-num>11-4226/Q</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[30]。2.3.11酶切鑒定測序圖2-1pET28a質(zhì)粒圖表2-8酶切體系組分含量NheIXhoI10XHBuffer質(zhì)粒（DNA）滅菌水反應溫度：37℃1μl1μl2μl≤1ngupto20μl雙酶切后根據(jù)電泳條帶大小驗證連接是否成功，并送去公司測序。第三章結果3.1基因序列查詢Caldicellulosiruptorchangbaisum中Cel5L基因在NCBI中的序列查詢結果如下：CCCTCACAGAGTTCATACCCCATGACCTTATTCCTTGCAATGCCGTCTCCAGTTTATCTCTGTACCAGCAATGTGCGTGATTGGTTCCTATCAATGTGCTTGTGTCAATTTTTGCTACTCCATTACCCGGTGTTGGTGTTGGAGTTGGTGTTACTGTTACTGTCGGCGTAGGTGTCACTGTCGGGGTCGGTGTTGGTGCAACCGTCACCGTCGGTGCAGGTGTTGGTGTTGGCGTTGAACTTGAGGATCCCTCTGGTTCTTGTCCCCATACCAGCACGTTACCTTCATAAGCTGCTATGAATTTATTTTTACTAAGTTCTTTTGTTAATCCTGCATACGATGGGTCATTAGTTGGATCCCATGGAACGTCTTGTGGTACAGAGATCTTAAATTGAGCTTGTTTTTTGTGTTCTACTTCCCCACCTGGATATATTTTTGTTCCTGTAAAATCAACTAATATATAGTAAAGGTTTTTTGACGCATTCCATACATATGGTCCAGATATCTTTCCACCTTCTGAATAATATGTCTCCACTTTAACAATATCAGGACCATACCCAGCCTTGATTAACTCACTTAGGTCAATAAAATACTTAAAGTTTAAAGTATCTGTGATTCGTGGGGGCCATCCTGTTCTGTTATAAATGTATGAAATTATTTCAGTATAGTTTGCACCCTGTGAATTACCAAACTTGGATTCAACAAAAATTTCATCATTAGTTGGCTTTTCGATAGCCTTGAAATTAGGTATTGGGTCTCCCCCATACATAAGGTACATTTTTGCTAGAGCACCCACAATACCAGCATTGTAGTCACAAGCCACCTCGTTTTGTACATAGTCAGTAATATCATCATTGTAACTATCATCAGAGCCTGGTCCGCCTACTAATGCACCATAAAGTATGTGTCGATGATATTCGGGTATTCGCATACTGTTCGCCCATGAACTATGTGCATTTCTGTGATGTGGATGTTGTGGATAATTTTGCCCAAATCCTACCAAAAAACTTCTTCCTGTTGAACCTAATGCATAATTAATCTGACTCTCACCAAATTTTAGATAAGCTGTTCGCTTATTTTCTGGACATCCCGACCAATCTGCATAAACAAACGCTAAGAAAGCTGCAGTTGTAGCATACCTAAGTGAGCCCCACCCTGTTAGCCATGCAAGACCTTTAGGTGTATATGTTATGTTATATGTCCAATGATCAAGATTTCTTTCAACAGCACCTTTATATATGTCTTTATTAGTAATCTTTGCCAAAAGTAATATTGCTCCGTATCTTACATCATCCCAGCACTGTGTCCATGTATTTGTA3.2引物設計結果根據(jù)引物設計原則，使用PrimerPremier5.0軟件對Cel5L的基因序列進行引物設計，并對引物進行NCBIblast評估。引物設計結果如下：（標紅部分為酶切位點）表3-1引物基因序列5’-3’S:GAATGCTAGCCCCTCACAGAAGTTCATA5’-3’A:ATGCCTCGACTACAAATACATGGACACA3.3CTAB法提取DNA 用CTAB法提取Caldicellulosiruptorchangbaisum基因組DNA，作為PCR模板DNA，模板DNA電泳結果圖如下：LaneM:DNAMarker；Lane1：基因組DNA。圖3.3基因組核酸電泳圖3.4電泳檢測PCR產(chǎn)物用所設計的引物進行PCRTaq

酶(大連寶生生物有限公司)50μL：表3-2PCR體系組分含量Taq(5

U/pcl)10xPCR

buffer

(Mg2+

plus)dNTP

Mixture

(各2.5

mM)模板DNA上游引物下游引物無菌蒸餾水0.5μL5μL4μL2uL1μL1μL36.5μL反應條件:

95℃5min變性94℃1min52℃1min30個循環(huán)72℃1min72℃10

min延伸將至4℃30min，取出后4℃保存?zhèn)溆谩７謩e在49~57℃的退火溫度下進行PCR。當以提取到的基因組DNA為模板時，僅當退火溫度為52℃時，出現(xiàn)了一條清晰的條帶，且無雜帶，約1300bp

，與預期結果一致。電泳圖如下：LaneM：DNAMarker；Lane1-3：PCR產(chǎn)物。圖3.4PCR產(chǎn)物核酸電泳圖3.5重組質(zhì)粒的構建及鑒定將PCR產(chǎn)物進行回收，并與pET28a載體連接導入DH5α中進行轉化，轉化后的DH5a大腸桿菌在含卡那霉素的培養(yǎng)基中出現(xiàn)白色的菌落初步表示已經(jīng)轉化成功。挑取單菌落，進行質(zhì)粒小提，（電泳如圖3.6）雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)大小約6300bp的線性條帶，（如圖3.7所示）說明目的基因成功的連接到pET28a載體上。5000bp-5000bp-圖3.6質(zhì)粒小提電泳圖LaneM：DNAMarker；Lane1：酶切產(chǎn)物。圖3.7雙酶切產(chǎn)物電泳圖3.6目的基因的測序目的基因的測序由生工完成，結果顯示本次實驗獲得的基因序列與實驗前查找到的Cel5L基因序列相符合，說明通過本實驗成功獲得嗜熱菌目標基因。測序結果如下：圖3-8序列對比討論本實驗主要是釣取一個新的嗜熱糖苷酶基因，嗜熱糖苷酶不僅具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，并且在催化過程中具有半衰期長，能抵抗熱變性作用、可防止微生物污染、可在高溫下進行催化反應，等一系列優(yōu)點，這些優(yōu)點提高了催化的大多數(shù)反應的反應速率，使糖類底物的溶解性也有所提高，同時還降低了整個反應體系的粘度，這些優(yōu)點使嗜熱糖苷酶受到廣泛關注。本研究根據(jù)基因工程原理，在NCBI上找到Caldicellulosiruptorchangbaisum的基因組序列，并且利用嗜熱菌酶Cel5L基因的CDS序列，使用PrimerPremier5.0設計引物，此過程要考慮發(fā)卡結構、二聚體、錯誤引發(fā)位置和引物間交叉二聚體等綜合評估ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>金笛</Author><Year>2016</Year><RecNum>16</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[31]</style></DisplayText><record><rec-number>16</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5zxswp9dftpsetesffnx5e5gx9dt0zxxa2ad"timestamp="1559619875">16</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>金笛</author><author>何麗</author><author>張海鋒</author></authors></contributors><auth-address>湖北中醫(yī)藥高等?？茖W校內(nèi)科教研室;湖北省荊州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科;湖北省荊州市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科;</auth-address><titles><title>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白與CXCL12蛋白在特發(fā)性肺纖維化中的表達及意義</title><secondary-title>重慶醫(yī)學</secondary-title></titles><periodical><full-title>重慶醫(yī)學</full-title></periodical><pages>4068-4070</pages><volume>45</volume><number>29</number><keywords><keyword>特發(fā)性肺纖維化</keyword><keyword>內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激</keyword><keyword>GRP78</keyword><keyword>CHOP</keyword><keyword>CXCL12</keyword></keywords><dates><year>2016</year></dates><isbn>1671-8348</isbn><call-num>50-1097/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[31]，還要注意的點是，連續(xù)的3個堿基相連的情況出現(xiàn)在兩條引物的3’端，會非常容易引起錯配現(xiàn)象ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>周珊珊</Author><Year>2011</Year><RecNum>17</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[32]</style></DisplayText><record><rec-number>17</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5zxswp9dftpsetesffnx5e5gx9dt0zxxa2ad"timestamp="1559619963">17</key></foreign-keys><ref-typename="Thesis">32</ref-type><contributors><authors><author>周珊珊</author></authors><tertiary-authors><author>陳愛華,</author></tertiary-authors></contributors><titles><title>Wnt-5a/Frizzled-2途徑對心肌缺血再灌注損傷后心肌Ca~(2+)變化的影響的研究</title></titles><keywords><keyword>Wnt-5a/Frizzled-2途徑</keyword><keyword>鈣離子超載</keyword><keyword>心肌缺血再灌注</keyword><keyword>全基因合成</keyword><keyword>siRNA</keyword></keywords><dates><year>2011</year></dates><publisher>南方醫(yī)科大學</publisher><work-type>博士</work-type><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[32]。最終綜合各方面因素，并經(jīng)過NCBI中Blast工具欄檢測，最終確定一對引物，引物序列為5’-3S:GAATGCTAGCCCCTCACAGAAGTTCATA5’-3’A:ATGCCTCGACTACAAATACATGGACACA。利用CTAB法提取Caldicellulosiruptorchangbaisum基因組DNA。PCR產(chǎn)物電泳結果分析，證明了設計的引物較為合適。對電泳條帶回收并連接PET28a載體，在大腸桿菌感受態(tài)細胞中轉化。挑取單克隆進行質(zhì)粒小提及酶切，并拿去公司測序。酶切圖及測序圖說明重組質(zhì)粒構建成功。本實驗的成功充分說明了找到的Caldicellulosiruptorchangbaisum的酶Cel5L的基因序列是正確的，并且設計的引物是合理的。該實驗確定了PCR反應體系和反應條件，成功釣取了一株全新的嗜熱糖苷酶基因。結論本文主要對嗜熱糖苷酶進行了研究。論文主要完成以下幾個方面的工作:1.NCBI找到了Caldicellulosiruptorchangbaisum的酶Cel5L基因的CDS序列。2.通過PrimerPremier5.0軟件及NCBI設計出了Caldicellulosiruptorchangbaisum的酶Cel5L的基因的引物。3.提取出了Caldicellulosiruptorchangbaisum基因組DNA。4.用PCR方法擴增出了Caldicellulosiruptorchangbaisum的酶Cel5L的基因。5.將PCR產(chǎn)物回收與pET28a載體相連接，構建重組質(zhì)粒。6.對重組質(zhì)粒進行篩選鑒定，確定成功連接。7.成功釣取了一株全新的嗜熱糖苷酶基因。致謝在此我要感謝在寫作過程中幫助過我的每一個人，首先，我要感謝我的指導老師王紅蕾老師，在整個過程中，給予了我巨大的幫助，首先她確定了我題目的大方向，讓我在寫作時有了具體的方向，在每一次我修改論文過后，老師都認真的閱讀我的文章，指出我存在的問題，在此十分感謝王紅蕾老師的耐心指導，讓我順利完成畢業(yè)論文。其次，我要感謝我的師兄龔忠闊，在我的整個實驗過程中給予了我很大的幫助尤其是在數(shù)據(jù)處理方面，給了我大力的幫助，使我能夠快速，高效的完成實驗。最后，我要感謝我的同學毛夢欣、胡美瓊、孫凡淑，他們在文獻查找以及論文寫作細節(jié)方面給予了我巨大的幫助，還有我要感謝姚小強先生給我精神上的支持和鼓勵。感謝支持和幫助過我的所有人，謝謝。最后，衷心感謝長春工業(yè)大學化學與生命科學學院四年來為我提供的良好環(huán)境，衷心感謝所有辛勤培有我的所有校領導和任課老師，感謝一路陪伴我走過大學生涯的同學，感謝他們在教會我知識的同時，也教會了我如何做人。祝愿長春工業(yè)大學培育出越來越多的優(yōu)秀人才，桃李滿天下。參考文獻ADDINEN.REFLIST[1]. 杜威.嗜熱菌β-糖苷酶基因乳腺特異性表達載體的構建、轉染及鑒定[碩士]:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2013.[2]. 郁惠蕾,許建和,林國強.糖苷水解酶在糖苷合成中的應用概況[J].有機化學.2006(08):1052-8.[3]. 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