廣西本地黃牛催產素的分泌釋放途徑

廣西本地黃牛催產素的分泌釋放途徑

催產素（ot）是核電站中發(fā)現并澄清結構的神經遺產，由腦神經內側的大細胞產生。這是一種由九個氨基酸組成的特殊結構的環(huán)狀激素，分子質量為1047u。OT在中性或堿性溶液中容易被破壞,而在酸性溶液中較為穩(wěn)定,在體內容易被消化酶和血液中的催產素酶所破壞。荷蘭著名大腦研究學者Swaab等首次利用免疫組化方法對小鼠的下丘腦催產素能神經元進行了定位描述。陳樹林等用原位雜交方法對成年發(fā)情期奶山羊下丘腦催產素及其表達測定發(fā)現了催產素mRNA的廣泛存在。越來越多的研究結果表明,OT樣神經元廣泛存在于下丘腦中的視上核、室旁核、弓狀核等27個核區(qū)。另外,研究還發(fā)現下丘腦OT可經神經垂體、第三腦室、血管3條途徑釋放,然后經血液循環(huán)最終作用于靶細胞而發(fā)揮生理作用。OT是一個最早被弄清楚的氨基酸序列,它有43種轉錄體,并且是能夠人工合成的肽類激素。隨后,對OT的研究進展極快,OT不僅能調節(jié)神經內分泌,而且與繁殖及育幼相關的行為和復雜的社會行為密切相關。目前除了已明確哺乳動物神經垂體存在OT外,在其他許多脊椎動物的神經垂體內也發(fā)現存在著一些結構和功能方面與OT類似的激素。迄今為止,關于OT的研究大多集中在OT的生理功能、臨床應用的研究,基礎研究的資料較少;關于OT在不同動物種屬中基礎研究方面,鼠和奶山羊的資料比較完整,而有關OT在牛體內的報道較少,國內外尚無OT在廣西本地水牛下丘腦-垂體-卵巢軸的研究報道。鑒于此,筆者進行了OT在廣西本地水牛下丘腦-垂體-卵巢軸的免疫組化定位的差異性研究,為培育廣西奶水牛提供基礎理論依據。1材料和方法1.1試驗動物1～2年齡廣西本地青年水牛(沼澤型)5頭,臨床健康,雌性,購于廣西壯族自治區(qū)南寧市肉聯(lián)廠,體重約300kg。1.2方法1.2.1免疫組化試驗將廣西本地水牛頸動脈放血致死后迅速取下牛頭,打開顱腔取出完整牛腦,分離下丘腦,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定3d;將取出的下丘腦在梯度酒精中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋;將包埋好的蠟塊作矢狀連續(xù)切片,片厚5μm,隔6取2,得到3套切片。第1套用于免疫組化;第2套作免疫組化陰性對照,用來確定試驗的特異性反應;第3套作Nissl染色,用于下丘腦的核團定位。核團定位參照BenGreenstein編寫的《ColorAtlasofNeuroscienceandNeurophsiology》、田九疇主編的《畜禽神經解剖學》、張培林主編的《神經解剖》及潘堂峰碩士論文《摩拉雜交水牛和廣西本地水牛下丘腦神經核團形態(tài)學及細胞構筑比較研究》中的描述。1.2.2有機熱試驗將廣西本地水牛頸動脈放血致死后迅速取下牛頭,打開顱腔剝離腦硬膜并暴露腦神經,切斷視交叉前部2條視神經、腦神經和垂體漏斗,暴露大腦底,切開鞍膈,取出牛腦,分離并取出垂體,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h。打開腹腔,迅速取出卵巢,延其縱軸將卵巢一分為二,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h。垂體和卵巢的處理同下丘腦。第1套用于免疫組化;第2套作陰性對照,用來確定試驗的特異性反應;第3套作HE染色,用于常規(guī)組織學觀察。1.2.3催化劑的制備將下丘腦、垂體、卵巢等組織切片依次浸入下列試劑:二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10min→二甲苯(Ⅲ)10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→70%乙醇5min→60%乙醇5min→50%乙醇5min→蒸餾水洗2min→PBS沖洗3次,每次5min→高壓修復1～1.5min→冷卻PBS沖洗3次,每次5min→3%過氧化氫20min→PBS沖洗3次,每次5min→封閉→滴加一抗,37℃恒溫箱孵育90min→PBS沖洗3次,每次5min→滴加二抗,37℃恒溫箱孵育30min→PBS沖洗3次,每次5min→DAB顯色(在顯微鏡下觀察)→水洗10min→蘇木精染色2～5min→自來水洗1min→1%鹽酸酒精分化數秒→自來水洗1min→烘干→中性樹脂封片。陰性對照試驗以0.01mol/LPBS液(pH值7.4)替代一抗,其他步驟同上。1.2.4用于檢測圖像面積、細胞數病理圖像分析儀由數碼顯微鏡及LEICQWIN圖像分析系統(tǒng)2部分組成,圖像分析軟件可以測量數量、直徑、面積、灰度值、光密度等指標。將制得的切片在數碼顯微鏡下觀察并拍照,將獲得的圖像存于計算機,用美國MediaCybernetics公司的Image-ProPlus6.0進行分析。Image-ProPlus自動測得所獲取圖像的面積(即視野面積)為59142.67μm2,高倍鏡(×40)下測量該圖像中陽性細胞大小(以平均直徑表示)、陽性細胞光密度值(不同于灰密度,光密度值越大,其陽性程度越高)等,低倍鏡(×10)下測量圖像中陽性細胞數(以具有細胞核細胞為準,壓線者亦記在內),結果用平均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。每套切片隨機抽取5張,其中下丘腦切片每個核團隨機取5個視野圖像,數據用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。2結果與分析2.1組織病理學檢測經免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景呈淺黃色或淺黃褐色,OT免疫反應陽性神經元呈深淺不等的黃褐色,根據胞體內反應顆粒著色的深淺可分為強陽性、中等陽性和弱陽性3種。強陽性細胞黑褐色,胞體內深褐色顆粒融合成團,染成一片;弱陽性細胞著色淺淡,細胞輪廓不清,在高倍鏡下方可見到胞質中有少量淺褐色顆粒中等陽性細胞介于兩者之間;對照組切片均為陰性,說明此方法結果可靠。光密度值表示陽性細胞著色程度,值越高,陽性細胞著色越深(表1)。2.1.1小鼠視上部細胞發(fā)育的特點下丘腦視上核(supraopticnucleus,SON)位于丘腦下部的基部,即下丘腦的視上區(qū)。其細胞屬分泌神經元,縱貫視前區(qū)、視上區(qū)和結節(jié)區(qū)嘴側部,橫跨內外側帶,包繞視交叉,呈一連續(xù)的長扁平板狀核團。沼澤型水牛該核細胞體積較大,細胞密集,陽性細胞呈強陽性,短梭形,胞質內可見大小不一的陽性顆粒(圖1)。2.1.2視上區(qū)的內核室旁核(Paraventricularnucleus,PVN)位于內側帶靠近室周帶處,即視上區(qū)的背中部,在視前核后上方、前核上方、背內側核上端的前方、室間孔的下方,呈卵圓形的核團。沼澤型水牛該核細胞胞核清晰可見,核仁清楚,細胞染色較深,OT免疫陽性細胞呈不明顯的空泡狀,顆粒豐富,多見三角形或四邊形細胞,偶見梭形,突起明顯,細胞間分布較松散,周圍有很多陽性纖維。2.1.3小細胞細胞組交叉上核(Nucleussuprachiasmaticus,SCH)位于視交叉上方,主要由呈梭形和卵圓形排列密集的小細胞和少量大細胞組成。沼澤型水牛該核細胞突起粗大、長、纖維多,OT免疫陽性產物主要分布于梭形的大細胞中,另外在一些無突起的小細胞中也有分布,細胞形態(tài)各異,體積中型,中等陽性,OT免疫陽性細胞染色深而密集,周圍可見陽性纖維。2.1.4視前外側核及pol的特性視前核(Preopticnucleus,NPO)位于視交叉上方,前核的前方,又分為視前內側核(Medialpreopticnucleus,POM)及視前外側核(Lateralpreopticnucleus,POL),兩者之間無明顯界限,整個核團由上至下呈梭形。沼澤型水牛該核細胞以中型細胞為主,細胞主要為梭形和卵圓形的小細胞,分布較松散,細胞成短梭形,胞質染色淺,胞核著色淺,可看到清晰的核仁。2.1.5nhp的核型后核(Posteriorhypothalamicnucleus,NHP)位于背內側核后方,乳頭體上方,呈寬帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞以中型細胞為主,細胞主要為梭形和卵圓形小細胞,細胞胞質染色淺,胞核著色淺,可看到清晰的核仁,OT陽性細胞呈中等陽性,短梭形,分布較松散。2.1.6充腹外側部弓狀核(Arcuatenucleus,ARC)位于視交叉后方,腹內側核下方,乳頭體前方,呈梭形橫臥于下丘腦腹側部。沼澤型水牛該核細胞分布較密集,OT陽性細胞呈強陽性,細胞體積較大,細胞形態(tài)以梭形、圓形、卵圓形為主,胞內胞外均有大量強陽性物質分布(圖2)。2.1.7回采過程中,內核和弓狀核的總體特征腹內側核(Ventromedialnucleus,VMN),位于背內側核及后核的下方、乳頭體前上方,弓狀核的背側部,由前向后呈橢圓形的核團。沼澤型水牛該核細胞以中小型細胞為主,OT陽性細胞呈強陽性,染色較深,細胞較小,核仁呈黑色,分布較松散,胞內胞外均有大量強陽性物質分布。2.1.8底物的周圍邊界乳頭體核(Mamillarybody,MB)為1對球形核團,突出于下丘腦底面,在下丘腦矢狀面上,位于下丘腦后下方,其上方是后核,前上方是腹內側核,前方是弓狀核,核團呈圓形,其周圍界限明顯。沼澤型水牛該核細胞OT陽性細胞較小,分布較松散,呈中等陽性,細胞呈蝌蚪狀、多角形,胞質偶見分布粗而短的陽性產物。2.1.9常網狀核團的形成前核(Anteriorhypothalamicnucleus,NHA)位于視交叉上核后上方、視前核的后方、背內側核的前方、室旁核的下方,呈后上向前下呈常帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞體積較大,細胞形態(tài)多以圓形、卵圓形、梭形為主,OT陽性細胞呈強陽性,胞核可見空泡,胞質染色較深,核仁呈黑色,細胞間分布較松散,胞漿內可見大小不一的陽性顆粒。2.1.1旁核和前核的之前和外側核團的結構背內側核(Dorsomedialnucleus,NDM)位于室旁核和前核的后方、下丘腦后核的前方、腹內側核的上方,由上往下呈寬帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞以中小型細胞為主,OT陽性細胞呈強陽性,胞質染色較深,呈深褐色,細胞呈不規(guī)則分布,環(huán)繞胞體為空泡。2.2染色切片的檢測經免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景淺黃色或黃褐色,OT免疫反應陽性產物呈深淺不等的棕黃色。對照組切片均為陰性,說明該試驗具有免疫反應的特異性。2.2.1ot免疫陽性產物在垂體中的分布(1)ot免疫陽性細胞密度腺垂體是體內最重要的內分泌腺,位于腦基底部靠近視丘下部,呈櫻桃狀。沼澤型水牛的腺垂體上僅見數量極少、染色很淡、纖細的OT免疫陽性細胞和纖維,纖維沿腺細胞走向,分支形成不規(guī)則的網絡狀。在中間部的粗大纖維和血管周圍被陽性物質包圍(圖3)。試驗發(fā)現,沼澤型水牛腺垂體中OT免疫陽性纖維豐富,平均光密度較低,為0.459±0.044;OT陽性纖維密度大,為“++++”。(2)青年期開發(fā)的雙組分纖維神經垂體位于腦垂體后部,主要由下丘腦束的無髓神經纖維和神經膠質分化而成的神經垂體細胞所組成。沼澤型水牛的神經垂體上可見少量呈斷續(xù)平行排列的OT陽性纖維,典型的纖維內含有大小不等的棕黃色或深黃色反應顆粒,膨大成圓形、桿形、梭形等,使纖維成串珠樣,或呈均質分布在纖維上,膨體所在纖維明顯相連,這些纖維彎曲細小,多分布于近下丘腦區(qū)域。青年期沼澤型水牛神經垂體上的OT免疫陽性纖維分支少、較短,有的形成纖維束,但數量少,有的交叉成不規(guī)則的網狀,這些纖維還在血管、血竇旁有較多分布。在OT免疫陽性纖維旁散在分布著一些黃色陽性顆粒,其大小不等,可能是被切斷的纖維。沼澤型水牛OT免疫陽性纖維粗大、長,纖維束較多,陽性顆粒多,膨體較多,分支較多,所含顆粒黃褐色,其中胞核呈藍色(圖4)。2.2.2生殖被膜細胞ot免疫陽性檢測經免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景無色或淺黃色,OT免疫反應陽性產物呈深淺不等的黃褐色,細胞呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等,大小不等,成堆或散在分布。其中,陽性細胞大小為(16.088±0.795)μm,陽性細胞數為265.30±2.93;平均光密度為0.235±0.033,OT免疫陽性面積為(122.537±0.116)μm2。根據胞體內反應顆粒著色的深淺可分為強陽性、中等陽性和弱陽性。強陽性細胞黑褐色,胞體內褐色顆粒融合成團,染成一片;弱陽性細胞著色淺淡,細胞輪廓不清,在高倍鏡下方可見胞質中有少量淺黃色顆粒;中等陽性細胞介于兩者之間。卵巢位于子宮底的后外側,與盆腔側壁相接。試驗中5頭牛的卵巢皮質和髓質均未發(fā)現有OT免疫陽性產物的分布,而在生殖上皮、卵泡顆粒細胞和黃體細胞發(fā)現有大量OT免疫陽性產物存在。卵泡顆粒細胞中OT免疫陽性細胞形態(tài)為卵圓形和圓形,陽性細胞數較多,主要以強陽性細胞為主,顆粒細胞越靠近卵泡腔,平均光密度值越低。生殖上皮發(fā)現有OT免疫陽性產物分布,細胞呈立方狀。沼澤型水牛卵巢生殖被膜細胞呈弱陽性。卵泡細胞胞核不著色呈空泡狀,居于中央或偏于一側,顆粒層細胞呈中等陽性(圖5)。2.2.3d現行體存在的細胞毒性和形態(tài)黃體為排卵后由卵泡迅速轉變成的富有血管的腺體樣結構。許多學者先后對反芻家畜(綿羊、牛、山羊)的周期黃體中OT的定位進行了研究報道。卿素珠等認為奶山羊黃體中的OT免疫反應細胞屬于彌散神經內分泌系統(tǒng)(DNES)的周圍部分;李兆才等在奶山羊黃體確定了DNES細胞的存在。但目前尚無DNES細胞分泌OT的直接證據,關于OT在黃體中的表達部位尚無定論。卵巢顆粒細胞在排卵到黃體化的過程中經歷了許多生化和分化方面的變化,如從排卵前增殖的顆粒細胞向非增殖的終末分化的黃體細胞的轉化,OT對不同分化階段的顆粒細胞具有分化作用。連續(xù)切片HE染色的對照觀察顯示,奶山羊周期黃體中的OT主要由大黃體細胞分泌,小黃體細胞也可產生少量OT,且OT陽性細胞以不規(guī)則圓形為主,兼有卵圓形、多角形等,陽性細胞主要為大黃體細胞。近年來的研究發(fā)現,黃體細胞除可分泌或表達孕酮、雌激素、前列腺素F2a和催產素等激素外,還表達一些細胞因子和激素的特異性受體。黃體中存在大量的OT免疫陽性產物,細胞以卵圓形和圓形為主。黃體細胞輪廓不清楚,著色較淺,免疫陽性物質均勻分布于整個黃體組織中(圖6)。3生理功能的影響已有的關于OT生理功能方面的研究表明,OT除在生殖活動的調節(jié)中發(fā)揮重要作用外,對心血管功能、消化功能、體液滲透壓、神經免疫也有調節(jié)作用,與應激反應、睡眠與覺醒、痛覺調制等有密切關系,并能改善母親期長期空間記憶,增加人類之間的信任感,對精神失調和社會行為的破壞(如自閉癥)有改善作用。生理功能的產生必定有其形態(tài)學基礎,OT合成部位的研究成為該領域的熱點。在該領域的動物研究方面,許多學者已對大鼠、倉鼠、樹鼩、人、豬、奶山羊等多種動物的OT神經元及纖維的分布、合成部位有過研究及驗證,但OT在下丘腦-垂體-卵巢軸的具體作用機制及途徑還有待進一步研究。3.1ot在廣西本地一核中的分布關于下丘腦OT免疫陽性神經元在動物中分布的報道很多。Monika研究發(fā)現,哺乳動物的OT神經元主要存在于下丘腦大細胞核、視上核和室旁核,其神經纖維主要投射到垂體后葉和正中隆起。陳樹林等、卿素珠等在多種動物的室旁核、視上核、穹窿周核、室周核、下丘腦外側區(qū)、下丘腦前核、環(huán)核和前聯(lián)合核等觀察到OT神經元,該試驗也在上述區(qū)域觀察到陽性神經元及數量不等的陽性纖維。試驗發(fā)現OT在沼澤型水牛的下丘腦中廣泛分布,視上核、背內側核等數十個核團(區(qū))均有分布,不僅分布在視上核和室旁核,在弓狀核亦見大量OT神經元,并以弓狀核分布最多。與陳樹林等研究結果類似。試驗還發(fā)現弓狀核中存在大量OT免疫陽性神經元,而弓狀核與視上核、背內側核均位于促垂體區(qū),該區(qū)域的內分泌細胞主要分泌促垂體激素,這提示了OT可能參與調節(jié)了垂體中某些激素的分泌。下丘腦一些血管被OT神經元及纖維環(huán)繞,在第三腦室附近的一些核團和弓狀核、穹窿、正中隆起等處有一些OT神經元的突起及神經纖維。這表明OT可經第三腦室(腦脊液)、血液、神經垂體3條途徑釋放,然后通過血液循環(huán)作用于靶細胞,與孫志宏等研究結果一致,從而對OT釋放途徑有了進一步的證實。各核團神經細胞的陽性產物光密度上有顯著差異,跟摩雜1代水牛研究中相應各核團的光密度也有顯著差異,這表明不同核團功能區(qū)域、不同種屬牛的神經元細胞因作用不同而出現內分泌功能上的差異,可能對生產性能有影響。OT在廣西本地水牛下丘腦中的分布與大部分文獻報道基本一致。將該試驗結果與OT在不同動物下丘腦中的分布進行比較,結果表明,OT在下丘腦中的分布存在種屬上的差異。OT免疫陽性神經纖維主要分布于下丘腦中弓狀核、腹內側核、前核及背內側核等核團,其出現在與神經內分泌相關的下丘腦核團中,提示OT可能參與了機體的生殖神經內分泌的調節(jié)。3.2ot對腺垂體激素合成的調節(jié)試驗發(fā)現,沼澤型水牛免疫陽