曲馬多對大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元

曲馬多對大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元

心悸是缺血性心臟病的重要臨床癥狀。μ1-阿片受體是對痛覺調(diào)制起重要作用的阿片受體亞型,丘腦束旁核(Pf)內(nèi)含有豐富的阿片能神經(jīng)末梢及其受體。中樞性鎮(zhèn)痛藥對Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達的影響,對于揭示心絞痛在急性心肌梗死(損傷)病理生理進程中的作用有重要的意義。本研究旨在觀察曲馬多預(yù)先給藥對急性心肌缺血大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達的影響,為臨床研究提供依據(jù)。阿片受體mrna表達量的測定動物選擇及分組健康成年雄性SD大鼠18只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重260～280g。隨機分為3組:假手術(shù)(S)組,結(jié)扎冠狀動脈(CAO)組,曲馬多(T)組,每組6只。動物模型制備腹腔注射20%烏拉坦1.2g/kg麻醉大鼠,術(shù)中必要時追加1/3劑量。然后行氣管切開,接小動物呼吸機行機械通氣,呼吸頻率為75次/min,潮氣量8ml·kg-1。T組CAO前15min靜脈注射曲馬多(批號346G,Grunenthal公司,德國)12.5mg·kg-1。CAO、T組在左胸骨旁第4,5肋間作1cm長切口,暴露心臟,剪開心包膜后用7-0無損傷縫線CAO左前降支,S組僅在冠狀動脈左前降支下穿線,不結(jié)扎,計時6h。然后逐層關(guān)胸,行胸腔負壓引流后,停止機械通氣,動物恢復(fù)自主呼吸。各組用微量泵經(jīng)尾靜脈持續(xù)泵入林格式液,速率10ml·h-1·kg-1。手術(shù)切口(包括氣管切開、開胸以及開顱手術(shù))術(shù)前均用0.125%布比卡因局部麻醉,總量不超過1ml。Pf位置標定將CAO后的大鼠固定于ST-7型立體定位儀(NarishigeGroup公司,日本)上。依照大鼠腦立體定位圖譜(以前囟為0點,距前囟向尾側(cè)4.0～4.2mm、距中縫旁開0.8～1.2mm、腦表面下5.5～6.5mm),鉆孔開顱顯露腦組織,用內(nèi)充3mol/LKCl溶液的單腔玻璃微電極(尖端直徑0.5～1.0μm)由微推進儀從腦表面垂直刺入,到達Pf后,用DP-301型微電泳儀(WarnerInstrument公司,美國)以Chicogao藍陰極電流(10μA,20min)進行Pf位置標定。指標測定CA06h后斷頭處死動物,經(jīng)主動脈根部全身灌注4℃4%多聚甲醛固定液300ml,取出腦組織,以標定的Pf位置為中心修成前后厚約0.3～0.4cm的腦塊,置于前述固定液中固定10min;然后放入4℃30%蔗糖(0.1mol/LPBS配制)中過夜至腦塊沉底。然后用LeicaCM-1850型恒冷箱切片機(Leica公司,德國)行15μm厚冠狀冰凍連續(xù)切片,室溫下空氣中風干,-70℃保存?zhèn)溆?。依照μl-阿片受體mRNA原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司)說明書的實驗步驟進行原位雜交染色。在BX51-型光學(xué)顯微鏡高倍鏡(Olympus公司,日本,×400)下,用IDA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)(中國科學(xué)院北京空海科技發(fā)展有限公司)對Pf部位μl-阿片受體mRNA染色陽性細胞進行半定量分析。通過組織切片上的電極標記點及神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)確認Pf位置,隨機選取以標記點為中心的周圍6個視野,每張切片隨機分析包括標記點在內(nèi)的7個視野,以積分光度值表示;μ1-阿片受體mRNA表達。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。cao和t組pf內(nèi)染色陽性神經(jīng)元/胞漿形態(tài)分布S組Pf內(nèi)有染色陽性神經(jīng)元無規(guī)律地零星、散在分布,胞漿不著色或輕度著色,胞核淺淡,神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,略顯模糊,細胞突起少;CAO組Pf內(nèi)染色陽性神經(jīng)元明顯增多,呈不對稱散在分布,神經(jīng)元形態(tài)多樣,輪廓清晰,細胞突起較多,胞漿呈棕黃色,胞核不著色或輕度著色;T組Pf內(nèi)染色陽性神經(jīng)元較少,胞漿著色較淺,細胞突起較少。T組Pf神經(jīng)元μl-阿片受體mRNA表達低于CAO組,但高于S組(P<0.05),見表1。曲馬多在cao對大鼠血清pf神經(jīng)元表達的抑制作用為防止在取出腦組織的過程中,由于取材和修塊的時間較長而有可能導(dǎo)致腦組織神經(jīng)元缺血、缺氧、變性、壞死而導(dǎo)致抗原的丟失,因此本研究經(jīng)主動脈根部全身灌注4℃4%多聚甲醛固定液300ml。丘腦在心絞痛發(fā)生的調(diào)制中發(fā)揮重要作用。丘腦Pf屬于丘腦髓板內(nèi)核群,是內(nèi)臟和軀體傷害性刺激的共同整合中樞,含有豐富的阿片能神經(jīng)末梢及其受體。μ1-阿片受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體,廣泛分布于丘腦等與痛覺感受和鎮(zhèn)痛有關(guān)的腦區(qū),其在痛覺調(diào)制中起主要作用。有研究表明,丘腦中μ1-阿片受體mRNA和μ-受體的分布一致。阿片受體是功能性的,各種傷害性刺激均可以激活體內(nèi)的阿片肽能活動,導(dǎo)致阿片受體上調(diào)和合成增加,從而有利于減弱機體對傷害性感受的易化作用。烏拉坦是一種靜脈長效麻醉藥,可用于腹腔、肌肉或皮下注射,作用時間長達6～10h。作用溫和持久,對呼吸及循環(huán)均無明顯抑制。本實驗采用20%烏拉坦麻醉大鼠,劑量1～1.2g/kg,麻醉效果可維持6h。在本課題以前所做的實驗中,將S、CAO、T組分別分為CAO1、3、6h三個時間點,CAO組Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA的表達以CAO6h最強,因此本研究便選擇了CAO6h。積分光度值可反映μ1-阿片受體mRNA表達陽性面積率與平均光度的綜合變化情況,敏感性高,因此本研究采用積分光度值來反映μ1-阿片受體mRNA的表達。本實驗結(jié)果表明,CAO明顯誘發(fā)大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達增加。因為心肌組織缺血及其傷害性刺激可使Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達上調(diào),該變化是機體對傷害性刺激的反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,曲馬多預(yù)先給藥能抑制CAO誘導(dǎo)的大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA的表達上調(diào),Jensen等的報道與本研究觀點一致。曲馬多對μ1-阿片受體有一定的選擇性,但親和性極低,因而不能單用阿片受體的機制來解釋其作用。Raffu等用阿片和非阿片因素共同作用來解釋其鎮(zhèn)痛作用,阿片因素即結(jié)合并激活μ1-阿片受體發(fā)揮作用。非阿片因素則是通過抑制去甲腎上腺素和5-羥色胺的再攝取,提高其在神經(jīng)元外水平,激活下行單胺能遞質(zhì)系統(tǒng)的脊髓抑制通路而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。其機理可能是:1.曲馬多作用于中樞的阿片受體,使心臟缺血傷害性刺激的傳導(dǎo)在脊髓和脊髓上水平產(chǎn)生直接和/或間接的抑制,降低了大鼠Pf痛覺敏感神經(jīng)元和疼痛抑制-興奮敏感神經(jīng)元的活動.并增加了大鼠Pf。5-HT的釋放,減弱了機體對傷害性沖動的感受,從而使其μ1-阿片受體mRNA的合成和表達減少。2.Stein等的研究表明,外源性阿片樣物質(zhì)引起腦內(nèi)