支氣管哮喘豚鼠腦內cfos基因的分布

支氣管哮喘豚鼠腦內cfos基因的分布

c-fos是指早期遺傳因子，參與各種細胞的培養(yǎng)和生物合成調節(jié)過程。哮喘是由多種炎癥細胞和炎癥介質介導形成的慢性氣道炎癥,已經證實c-fos參與其炎癥反應。然而,哮喘發(fā)作是否能導致豚鼠腦內相關核團c-fos發(fā)生變化,至今仍不清楚。本研究復制豚鼠哮喘模型,誘導c-fos原癌基因表達,用免疫組織化學法觀察哮喘激活的腦區(qū),以初步探討神經中樞與哮喘發(fā)病的相關性。1材料和方法1.1動物和食物成年健康豚鼠14只,雌雄不分,體重350～450g,由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。隨機分為哮喘組(n=10)和對照組(n=4)。1.2哮喘組1.2.1氫氧化鋁形式采用卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏和激發(fā)復制豚鼠哮喘模型。第1天腹腔內及皮下分別注射含20mg氫氧化鋁的1%OVA生理鹽水溶液1.5mL及0.5mL,一周后重復注射加強致敏,第四周動物以8L/min驅動流速Wright霧化器吸入1%OVA生理鹽水溶液3～5min激發(fā)哮喘發(fā)作。哮喘豚鼠表現(xiàn)為呼吸急促,腹式呼吸,跌倒。誘發(fā)哮喘1h后開始以下步驟。1.2.2常規(guī)he染色豚鼠腹腔內注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉,開胸經左心室至升主動脈插管,先以100mL生理鹽水沖洗血液,隨后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PB,pH7.4)灌流固定。灌畢取全腦及包括氣管和主支氣管的整個肺組織置于含30%蔗糖的0.1mol/LPB內(4℃)至組織塊沉底。恒冷箱連續(xù)冠狀切片,片厚30μm,貼片于1%明膠0.05%硫酸鉻鉀處理過的載玻片上。室溫干燥30min后,取部分肺葉切片進行常規(guī)HE染色,其它切片用0.01mol/L的KPBS(pH7.4)浸洗,經80%甲醇+0.3%H2O2封閉,入含0.3%TritonX-100處理,然后按ABC法先進行抗Fos免疫組化反應。依次孵育于:兔抗Fos抗體稀釋液(1∶3000,SantaCruz)24h(4℃),生物素標記的羊抗兔IgG(1∶500,Vector)2h(室溫)和生物素-卵白素-HRP復合物(ABC,1∶500,Vector)2h(室溫)。以上每一步驟之后均用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)充分漂洗3次,每次10min。然后用葡萄糖氧化酶-二氨基聯(lián)苯胺-硫酸鎳銨法呈色。最后常規(guī)裱片、脫水、透明、中性樹膠封固、光鏡觀察。1.3對照組1.3.1生理鹽水比較試驗n.4用生理鹽水代替1%OVA生理鹽水溶液,其它步驟同哮喘組。1.3.2免疫組織化學染色的替代試驗取實驗組豚鼠部分大腦切片,用0.01mol/LPBS代替兔抗Fos第一抗體,再按ABC法進行免疫組化染色。1.4ca處理動物腦內fos陽性細胞的表達切片經圖像分析儀(Quantimet570C,Leica)處理。每只豚鼠隨機選取一套大腦切片,計算該套切片中各腦區(qū)內Fos陽性細胞的總和,而后在每組動物間取均數(shù)。哮喘組和對照組之間數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計分析比較。2結果2.1肺疾病的病理改變以及c-fos的出現(xiàn)2.1.1炎癥細胞截面哮喘組氣道壁和肺組織中可見大量炎癥細胞浸潤(主要為嗜酸性粒細胞和多形核白細胞),粘膜水腫,管壁內可見大量滲出的炎癥細胞(圖1)。對照組動物氣道壁偶見少量炎癥細胞浸潤,粘膜結構完整。2.1.2fos陽性細胞Fos蛋白免疫反應陽性物質呈藍黑色,主要分布于上皮細胞和多形核白細胞的胞核,胞質呈陰性反應,反差鮮明。哮喘組氣道壁及肺組織中可見大量的Fos陽性細胞,主要為粘膜上皮細胞和浸潤的炎癥細胞,陽性炎癥細胞主要分布于粘膜層、粘膜下層及平滑肌周圍。對照組動物氣道及肺組織中無或偶見免疫反應極弱的Fos陽性細胞。2.2c-fos在大腦中的表達2.2.1fos陽性細胞的分布、分布與延髓額葉皮質(Ⅰ、Ⅱ區(qū))、扣帶皮質(Ⅰ、Ⅱ區(qū))、梨狀皮質(圖2A)和中央杏仁核(圖2B)內有中等密度的Fos陽性分布。頂葉皮質、側腦室周灰質、斜角帶核及穹隆下器內散在分布。其它皮質及核團分布均稀少。下丘腦和丘腦區(qū)域Fos陽性產物主要密集分布于下丘腦室旁核(圖2C)、丘腦室旁核和視上核(圖2D),下丘腦外側區(qū)和下丘腦室周核等有中等密度的分布,正中隆起內亦可見到少許Fos表達。小腦內無明顯Fos分布密集區(qū)。中腦導水管周圍灰質、臂旁核和腦橋核內有少量的Fos陽性分布。Fos陽性細胞在延髓的分布主要密集分布于中、尾段延髓的孤束核聯(lián)合亞核、內側亞核和最后區(qū)(圖2E)內,其次分布于延髓腹外側區(qū)(圖2F)內。中間網狀核、三叉神經脊束核和下橄欖核等也有少量的Fos分布。2.2.2免疫組織化學染色生理鹽水對照組豚鼠腦內僅有散在的Fos分布,多為淺染且數(shù)量很少,無明顯密集分布區(qū)。免疫組織化學染色替代實驗的切片反應呈陰性。上述各部腦區(qū)及核團內Fos陽性細胞的圖像分析結果見表1。3fos蛋白形態(tài)學顯示方法在免疫調節(jié)中的應用目前大量研究已證實支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T細胞等多種炎癥細胞參與的氣道慢性炎癥,但哮喘的發(fā)病機制至今尚未完全闡述清楚。體液免疫和細胞免疫都可參與哮喘的發(fā)病,而且速發(fā)型變態(tài)反應和遲發(fā)型變態(tài)反應也與哮喘的發(fā)病相關。神經免疫調節(jié)學是神經科學領域最新的分支之一,大量證據(jù)表明中樞神經系統(tǒng)(CNS)和免疫系統(tǒng)之間存在雙向的聯(lián)系。免疫應答過程可影響CNS的活動,CNS可接受免疫刺激信息并參與對免疫反應的調節(jié)。支氣管哮喘的免疫應答是否有CNS的參與、以及其參與哮喘免疫應答的具體部位,現(xiàn)在仍不甚清楚。原癌基因c-fos及其表達產物Fos蛋白在神經元活動時表達活躍,被廣泛用作神經元興奮的標志物。Fos蛋白形態(tài)學顯示方法的建立為研究免疫刺激信息的傳導通路提供了一個快捷、敏感和方便的研究手段。雖然結果是通過形態(tài)學方法顯示,但在某種程度上反映了一定的功能意義,因此是一種形態(tài)學和功能學相結合的指標。多種刺激均可引起Fos蛋白陽性表達,但在嚴格控制實驗條件的前提下,Fos顯示方法仍是一種非常方便和分辨率很高的方法。下丘腦是免疫應答的一個重要整合中樞,在神經免疫調節(jié)的研究中,常將下丘腦作為焦點。實驗中我們觀察到卵蛋白霧化吸入誘發(fā)的支氣管哮喘不僅肺臟中c-fos表達較正常豚鼠明顯增加,而且包括下丘腦在內的一些腦區(qū),如額頂皮質、邊緣前腦(扣帶皮質、梨狀皮質和中央杏仁核等)、丘腦室旁核、下丘腦室旁核、視上核、下丘腦外側區(qū)、下丘腦室周核、孤束核、最后區(qū)和延髓腹外側區(qū)可被激活。我們推測上述部位原癌基因c-fos表達可能與哮喘神經免疫調節(jié)密切相關。大鼠延髓中尾段存在一條從背內側經中間網狀結構至腹外側的弧形帶狀區(qū)—延髓內臟帶(MVZ),MVZ主要包括孤束核(NTS)、最后區(qū)(AP)和延髓腹外側區(qū),與內臟活動(心血管、呼吸和胃腸活動等)和神經免疫調節(jié)密切相關。卵蛋白刺激氣道,可以記錄到迷走神經感覺神經節(jié)—結狀神經節(jié)放電增加。本文結果顯示MVZ及其上行投射神經核團(下丘腦、杏仁核等)均有Fos表達,這提示MVZ可能與支氣管哮喘的神經免疫調節(jié)調控相關。腹腔免疫信息可由迷走神經傳遞經MVZ中繼再上傳至下丘腦室旁核和中央杏仁核,哮喘所致的免疫刺激可否也可經迷走神經傳遞至MVZ再上傳到下丘腦等高位中樞還待進一步研究證實。近年的研