頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)耐甲氧西林金葡菌的效果評(píng)價(jià)

頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)耐甲氧西林金葡菌的效果評(píng)價(jià)

自抗生素出版以來(lái)，細(xì)菌藥物的問題一直在發(fā)生。治療耐青霉素葡萄球菌的藥物甲氧西林使用僅兩年,Jevens就報(bào)道了耐甲氧西林金葡菌的出現(xiàn),之后耐藥性日趨嚴(yán)重,現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一。因此對(duì)MRSA進(jìn)行準(zhǔn)確有效的檢測(cè)及耐藥性分析,對(duì)控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行,指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。本文以特異性mecA基因PCR檢測(cè)法為參考方法對(duì)頭孢西丁與苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測(cè)MRSA進(jìn)行比較分析,并對(duì)42株MRSA進(jìn)行耐藥性分析。1材料和方法1.1材料表面1.1.1mrsa的分離和鑒定2004年4月至2004年12月間臨床感染標(biāo)本分離獲得95株MRSA,其中痰24株、分泌物9株、咽拭子2株、深靜脈置管2株、血1株、尿1株、膿液1株、組織1株。1.1.2美國(guó)運(yùn)行u3000美國(guó)(1)11種抗生素紙片(青霉素、紅霉素、苯唑西林、頭孢西丁、克林霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢呋辛、奈替米星、左氧氟沙星、氨芐西林/舒巴坦和頭孢唑林)由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。(2)MH瓊脂購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)公司。(3)mecA引物選自金葡菌PBP2a開放閱讀框,PCR引物1:5′-AAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3′,PCR引物2:5′-AGTTCTGCAGTACCGGATT-TGA-3′,引物由上海復(fù)星公司合成,并提供配套試劑(DNA提取液、TaqDNA聚合酶、dNTP等)。(4)金葡菌膠乳凝集試劑購(gòu)于法國(guó)Bio-Merieux公司。1.1.3儀器PCR擴(kuò)增儀PE-9700由美國(guó)PE公司生產(chǎn);電泳檢測(cè)系統(tǒng)為美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品。1.1.4質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的蘑菇金葡菌ATCC25923和金葡菌ATCC43300。1.2方法1.2.1金葡菌的鑒定常規(guī)培養(yǎng)分離細(xì)菌,用金葡菌膠乳凝集試劑鑒定,凝集試驗(yàn)陽(yáng)性確定為金葡菌。1.2.2苯唑林斯基苯磺酸鹽的抑菌效果將純培養(yǎng)金葡菌液調(diào)至1.5×108CFU/ml,均勻涂抹于厚度為4mm的MH瓊脂平板上,將含量為每片1μg的苯唑西林貼于平板上,35℃孵育24h,抑菌圈直徑≤10mm為耐藥,≥13mm為敏感。1.2.3頭孢西丁貼/平板平板法將純培養(yǎng)金葡菌液調(diào)至1.5×108CFU/ml,均勻涂抹于厚度為4mm的MH瓊脂平板上,將含量為每片30μg的頭孢西丁貼于平板上,35℃孵育24h,抑菌圈直徑≤19mm為耐藥,≥20mm為敏感。1.2.4pcr擴(kuò)增總dna提取取純培養(yǎng)金葡菌及標(biāo)準(zhǔn)菌株,用無(wú)菌生理鹽水配成3×108CFU/ml,各取菌懸液10μl加DNA提取液50μl(嚴(yán)格按PCR配套試劑說(shuō)明書操作),100℃水浴10min,15000r/min離心5min,取5μl上清液擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl于2.0%瓊脂糖(內(nèi)含0.5μg/L溴乙啶)TEB緩沖系統(tǒng)電泳,紫外透射下檢測(cè)。1000bp出現(xiàn)條帶為陽(yáng)性。1.2.510種抗生素km-p按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院CLSI(原NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。2結(jié)果2.1meca基因檢測(cè)結(jié)果見表1。(1)近年來(lái),研究證明mecA基因是金葡菌耐甲氧西林的主要分子基礎(chǔ),檢出mecA基因是目前公認(rèn)的判斷MRSA的主要標(biāo)準(zhǔn)。95株金葡菌中檢出mecA基因陽(yáng)性株42株,即MRSA42株。(2)頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)出40株MRSA,其中mecA基因陽(yáng)性株39株,另1株為假陽(yáng)性MRSA,漏檢3株MRSA。方法特異性97.5%,靈敏度92.9%。(3)苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測(cè)出44株MRSA,其中mecA基因陽(yáng)性株36株,另8株為假陽(yáng)性MRSA,漏檢6株MRSA。方法特異性為81.8%,靈敏度85.7%。2.24耐藥藥物及耐藥結(jié)果見表2。MRSA對(duì)青霉素、苯唑西林100%耐藥,對(duì)萬(wàn)古霉素全部敏感,對(duì)紅霉素、頭孢唑林、克林霉素、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、左氧氟沙星、奈替米星表現(xiàn)不同程度的耐藥。MSSA對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素耐藥性分別為98.1%、71.7%、35.8%,對(duì)其他抗生素敏感性均較高。3診斷結(jié)果的比較結(jié)果(1)MRSA檢測(cè)的方法學(xué)目前研究認(rèn)為mecA基因是MRSA的主要耐藥分子基礎(chǔ),檢測(cè)mecA基因是判斷MRSA的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。但由于設(shè)備、費(fèi)用等限制,不易在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。紙片擴(kuò)散法快速、簡(jiǎn)便,價(jià)格便宜,易被檢驗(yàn)人員接受。由于紙片擴(kuò)散法是針對(duì)表型檢測(cè)MRSA,而MRSA的表型表達(dá)通常是不均一的,因此給檢測(cè)帶來(lái)一定困難,容易出現(xiàn)誤差,例如,研究結(jié)果所示苯唑西林紙片法檢測(cè)出8株假陽(yáng)性MRSA,漏報(bào)6株,特異性及靈敏度略超過(guò)80%;頭孢西丁紙片法檢出假陽(yáng)性MRSA1株,漏報(bào)3株。但其特異性、敏感性較苯唑西林紙片法均有提高(P<0.05),減少了非mecA基因介導(dǎo)的假M(fèi)RSA檢出,提高了MRSA檢出率,因此2004年CLSI推薦將頭孢西丁代替苯唑西林檢測(cè)mecA基因介導(dǎo)的MRSA。此舉降低了假M(fèi)RSA造成的醫(yī)療浪費(fèi)及漏檢引起的治療失敗,使臨床醫(yī)生對(duì)這類感染的治療更有針對(duì)性。(2)MRSA除對(duì)甲氧西林耐藥外,對(duì)其他所有與甲氧西林有相同結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類和β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗生素均耐藥,還可通過(guò)改變抗生素作用靶位、產(chǎn)生修飾酶、降低膜通透性等機(jī)制,對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類等抗生素產(chǎn)生不同程度耐藥,惟有