il-1對(duì)室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動(dòng)的影響

il-1對(duì)室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動(dòng)的影響

1白細(xì)胞介素（il-1）引起了認(rèn)知高血壓發(fā)病機(jī)制的影響。而且,下丘腦室旁核在恐懼等應(yīng)激刺激誘發(fā)的心血管反應(yīng)中也具有重要作用。以往的研究顯示,下丘腦室旁核內(nèi)的血管緊張素1型受體(angiotensinⅡtype1receptor,AT1R)可以介導(dǎo)IL-1β引起的升壓反應(yīng);同時(shí),IL-1β可以促進(jìn)室旁核內(nèi)AT1R的表達(dá)增強(qiáng),因此,我們?cè)O(shè)想室旁核內(nèi)IL-1β可能興奮其神經(jīng)元的放電效應(yīng),且其作用可能與AT1R有關(guān)。有關(guān)IL-1β對(duì)室旁核中各類(lèi)放電單位的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道,故本實(shí)驗(yàn)采用腦薄片細(xì)胞外技術(shù),觀察了IL-1β對(duì)室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動(dòng)的影響,并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及許可證28只雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量為(200±30)g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)2003-0001,使用許可證號(hào):SYXK(吉)2003-0001。1.2試劑IL-1β(SI-I2393,Sigma);ACSF成分:NaCl124mmol/L、KCl5mmol/L、NaH2PO41.24mmol/L、MgSO41.3mmol/L、CaCl22.4mmol/L、NaHCO326mmol/L、葡萄糖10mmol/L,pH7.35～7.45(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)。1.3acsf-u-pbf腦片層析制備1.3.1離體腦片的制備及灌流:將大鼠迅速斷頭,取出全腦置入預(yù)先用95%O2和5%CO2飽和的低溫(0～4℃)人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)中,根據(jù)解剖標(biāo)志切下并修整含有PVN的腦組織塊4mm×4mm×4mm后,快速用粘合劑將組織塊粘于振動(dòng)切片機(jī)的推進(jìn)臺(tái)上,用振動(dòng)切片機(jī)緩慢切除厚350～400μm的腦薄片。腦薄片在室溫下置于連續(xù)通以95%O2和5%CO2混合氣體的ACSF中孵育1～2h后,將腦薄片移至記錄槽內(nèi),用雙層尼龍網(wǎng)固定。記錄槽位于恒溫浴槽中央,容量約1mL,采用全浸式灌流。用電子微量泵將ACSF灌入記錄槽內(nèi),流速為2.5mL/min。灌流液的溫度由恒溫儀控制在(34±1)℃。1.3.3給藥方式:每次實(shí)驗(yàn)前先找到自發(fā)放電單位,待放電頻率穩(wěn)定10min后,取3～5min的平均放電頻率作對(duì)照,然后灌流藥物,以神經(jīng)元放電的頻率升高或降低20%以上分別為增頻反應(yīng)(興奮單位)或減頻反應(yīng)(抑制單位)。觀察到神經(jīng)元對(duì)藥物有反應(yīng)后,用人工腦脊液沖洗,待放電恢復(fù)至對(duì)照水平,必要時(shí)重復(fù)給藥。1.4統(tǒng)計(jì)處理所得數(shù)據(jù)均用表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,對(duì)灌流藥物前后的放電頻率進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1自發(fā)放電明顯增多在16個(gè)腦片上共觀察了59個(gè)室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電單位,其放電形式不規(guī)則,平均放電頻率為(1.09±0.40)Hz。實(shí)驗(yàn)前先找到自發(fā)放電單位,待記錄穩(wěn)定8～10min后灌流IL-1β(1×10-7mol/L),2～3min后在59個(gè)放電單位中有46個(gè)(78%)放電單位自發(fā)放電明顯增多,平均放電頻率由對(duì)照的(1.09±0.40)Hz增加到(2.20±0.43)Hz(P<0.01),興奮率為(75.97±3.60)%,其中藥物效應(yīng)時(shí)間為2～16min,平均(7.42±3.33)min;4個(gè)單位(6%)的放電頻率減少,由對(duì)照的(1.09±0.38)Hz減少到(0.87±0.23)Hz;9個(gè)(16%)單位的放電頻率無(wú)明顯變化,灌流IL-1β前后放電頻率分別為(1.09±0.36)Hz和(1.08±0.35)Hz(圖1)。2.2不同放電頻率的聚合反應(yīng)17個(gè)放電單位灌流IL-1β(1×10-7mol/L)后12個(gè)放電頻率明顯增加,由對(duì)照的(1.19±0.42)Hz增加到(2.18±0.43)Hz。在對(duì)IL-1β(1×10-7mol/L)呈興奮反應(yīng)的12個(gè)放電單位中,用氯沙坦(1×10-6mol/L)灌流后,除2個(gè)放電頻率無(wú)明顯變化,其余10個(gè)單位放電頻率減少至(1.72±0.53)Hz,放電活動(dòng)被抑制,低于灌流氯沙坦前(P<0.05);但又高于對(duì)照(P<0.05)(圖2)。IL-1β的增頻效應(yīng)部分被阻斷,氯沙坦能抑制由IL-1β引起的增頻反應(yīng)。3室旁核神經(jīng)元/at1r抑制劑的激活作用下丘腦室旁核被認(rèn)為是介導(dǎo)應(yīng)激刺激,誘發(fā)心血管反應(yīng)的重要靶點(diǎn),其神經(jīng)細(xì)胞接受多種神經(jīng)遞質(zhì)的作用,通過(guò)激活相應(yīng)受體引起心血管活動(dòng)的改變。大鼠下丘腦室旁核存在IL-1β免疫陽(yáng)性細(xì)胞及豐富的神經(jīng)纖維投射。放射自顯影方法發(fā)現(xiàn)大鼠各腦區(qū)均有散在分布的AngⅡ受體,其中室旁核神經(jīng)元是分布密度最大的核團(tuán)之一。雖然在整體實(shí)驗(yàn)中觀察到IL-1β對(duì)心血管活動(dòng)的影響,但用電生理手段研究IL-1β對(duì)離體下丘腦室旁核神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響及其相關(guān)機(jī)制,國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中,我們首先觀察了IL-1β對(duì)正常大鼠室旁核神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響,結(jié)果表明大鼠下丘腦室旁核的部分神經(jīng)元對(duì)IL-1β敏感,主要呈現(xiàn)興奮效應(yīng),潛伏期也很短,提示IL-1β對(duì)大部分室旁核神經(jīng)元的自發(fā)放電具有興奮作用。少數(shù)室旁核神經(jīng)元表現(xiàn)為抑制效應(yīng),可能是通過(guò)局部的神經(jīng)環(huán)路IL-1β擴(kuò)散至鄰近的抑制性神經(jīng)元,使其興奮而導(dǎo)致抑制性遞質(zhì)的釋放所致;也可能與室旁核神經(jīng)元細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān)。還有少數(shù)室旁核神經(jīng)元無(wú)明顯反應(yīng),可能意味著這些神經(jīng)元缺乏IL-1β作用相應(yīng)的受體。我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)也顯示,在大鼠室旁核內(nèi)微量注射IL-1β,出現(xiàn)明顯的血壓增高及心率增快反應(yīng),說(shuō)明IL-1β作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì),對(duì)室旁核神經(jīng)元有緊張性激活作用。IL-1β對(duì)室旁核神經(jīng)元可能有多種作用途徑,并在機(jī)制上互相影響,互為因果。楊麗明等已證明,AngⅡ等多肽對(duì)同一室旁核神經(jīng)元作用時(shí),發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的神經(jīng)元可同時(shí)對(duì)其中兩種多肽起反應(yīng),提示室旁核神經(jīng)元可能是神經(jīng)內(nèi)分泌和植物性功能調(diào)節(jié)的一個(gè)中樞整合部位。近年來(lái),Ufnal等在側(cè)腦室注射AT1R阻滯劑,可消除中樞應(yīng)用IL-1β引起的升壓反應(yīng),并認(rèn)為這種作用的中樞部位可能是下丘腦的室旁核。我們?cè)^察到IL-1β誘發(fā)的升壓效應(yīng)部分是通過(guò)下丘腦室旁核AT1R介導(dǎo)的,同時(shí)IL-1β可以增加室旁核內(nèi)AT1R的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)IL-1β呈興奮反應(yīng)的神經(jīng)元中用氯沙坦灌流后,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)元對(duì)IL-1β的興奮作用可被氯沙坦部分阻斷。由于氯沙坦是AT1R的特異性拮抗劑,與AT1R結(jié)合可抑制其激活而增加下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的放電效應(yīng),提示AT1R可能參與了IL-1β對(duì)室旁核神經(jīng)元的興奮作用。Gurantz等研究證明IL-1β可通過(guò)激活NF-κB增加大鼠心肌AT1R的密度,Yoshida等報(bào)道IL-1β呈劑量依賴性刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞AT1R的表達(dá)增強(qiáng)。Cowling等認(rèn)為中樞IL-1β能激活下丘腦神經(jīng)細(xì)胞NF-κB的表達(dá),而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是誘導(dǎo)AT1RmRNA上調(diào)改變的必需因子;我們前期的實(shí)驗(yàn)也顯示了側(cè)腦室給予IL-1β可使室旁核內(nèi)AT1R蛋白增多,均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng),并且相互解釋。IL-1β的最終效應(yīng)不僅取決于對(duì)神經(jīng)元的直接作用,而且可能與該區(qū)心血管的血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān),因此,IL-1β作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)對(duì)室旁核神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞放電的影響,可能是通過(guò)下丘腦室旁核介導(dǎo)的發(fā)熱、厭食、對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)以及對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌及代謝的影響來(lái)實(shí)現(xiàn),特別是在應(yīng)激性防御反應(yīng)中起到了一定的作用,進(jìn)一步說(shuō)明IL-1β作為一種多效性細(xì)胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。1.3.2室旁核單位放電記錄及組織學(xué)定位:參考Paxinos和Watson圖譜,在解剖顯微鏡下用微電極推進(jìn)器,將玻璃微電極(尖端直徑0.8～1.0μm,內(nèi)充灌含有2%滂胺天藍(lán)的0.5mol/L醋酸鈉