il-1對室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動的影響

il-1對室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動的影響

1白細胞介素（il-1）引起了認知高血壓發(fā)病機制的影響。而且,下丘腦室旁核在恐懼等應激刺激誘發(fā)的心血管反應中也具有重要作用。以往的研究顯示,下丘腦室旁核內的血管緊張素1型受體(angiotensinⅡtype1receptor,AT1R)可以介導IL-1β引起的升壓反應;同時,IL-1β可以促進室旁核內AT1R的表達增強,因此,我們設想室旁核內IL-1β可能興奮其神經(jīng)元的放電效應,且其作用可能與AT1R有關。有關IL-1β對室旁核中各類放電單位的作用及其機制尚未見報道,故本實驗采用腦薄片細胞外技術,觀察了IL-1β對室旁核神經(jīng)元自發(fā)電活動的影響,并對其可能機制進行初步探討。1材料和方法1.1實驗動物及許可證28只雄性Wistar大鼠,體質量為(200±30)g,由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2003-0001,使用許可證號:SYXK(吉)2003-0001。1.2試劑IL-1β(SI-I2393,Sigma);ACSF成分:NaCl124mmol/L、KCl5mmol/L、NaH2PO41.24mmol/L、MgSO41.3mmol/L、CaCl22.4mmol/L、NaHCO326mmol/L、葡萄糖10mmol/L,pH7.35～7.45(上?；瘜W試劑采購供應站)。1.3acsf-u-pbf腦片層析制備1.3.1離體腦片的制備及灌流:將大鼠迅速斷頭,取出全腦置入預先用95%O2和5%CO2飽和的低溫(0～4℃)人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid,ACSF)中,根據(jù)解剖標志切下并修整含有PVN的腦組織塊4mm×4mm×4mm后,快速用粘合劑將組織塊粘于振動切片機的推進臺上,用振動切片機緩慢切除厚350～400μm的腦薄片。腦薄片在室溫下置于連續(xù)通以95%O2和5%CO2混合氣體的ACSF中孵育1～2h后,將腦薄片移至記錄槽內,用雙層尼龍網(wǎng)固定。記錄槽位于恒溫浴槽中央,容量約1mL,采用全浸式灌流。用電子微量泵將ACSF灌入記錄槽內,流速為2.5mL/min。灌流液的溫度由恒溫儀控制在(34±1)℃。1.3.3給藥方式:每次實驗前先找到自發(fā)放電單位,待放電頻率穩(wěn)定10min后,取3～5min的平均放電頻率作對照,然后灌流藥物,以神經(jīng)元放電的頻率升高或降低20%以上分別為增頻反應(興奮單位)或減頻反應(抑制單位)。觀察到神經(jīng)元對藥物有反應后,用人工腦脊液沖洗,待放電恢復至對照水平,必要時重復給藥。1.4統(tǒng)計處理所得數(shù)據(jù)均用表示,采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理,對灌流藥物前后的放電頻率進行配對t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1自發(fā)放電明顯增多在16個腦片上共觀察了59個室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電單位,其放電形式不規(guī)則,平均放電頻率為(1.09±0.40)Hz。實驗前先找到自發(fā)放電單位,待記錄穩(wěn)定8～10min后灌流IL-1β(1×10-7mol/L),2～3min后在59個放電單位中有46個(78%)放電單位自發(fā)放電明顯增多,平均放電頻率由對照的(1.09±0.40)Hz增加到(2.20±0.43)Hz(P<0.01),興奮率為(75.97±3.60)%,其中藥物效應時間為2～16min,平均(7.42±3.33)min;4個單位(6%)的放電頻率減少,由對照的(1.09±0.38)Hz減少到(0.87±0.23)Hz;9個(16%)單位的放電頻率無明顯變化,灌流IL-1β前后放電頻率分別為(1.09±0.36)Hz和(1.08±0.35)Hz(圖1)。2.2不同放電頻率的聚合反應17個放電單位灌流IL-1β(1×10-7mol/L)后12個放電頻率明顯增加,由對照的(1.19±0.42)Hz增加到(2.18±0.43)Hz。在對IL-1β(1×10-7mol/L)呈興奮反應的12個放電單位中,用氯沙坦(1×10-6mol/L)灌流后,除2個放電頻率無明顯變化,其余10個單位放電頻率減少至(1.72±0.53)Hz,放電活動被抑制,低于灌流氯沙坦前(P<0.05);但又高于對照(P<0.05)(圖2)。IL-1β的增頻效應部分被阻斷,氯沙坦能抑制由IL-1β引起的增頻反應。3室旁核神經(jīng)元/at1r抑制劑的激活作用下丘腦室旁核被認為是介導應激刺激,誘發(fā)心血管反應的重要靶點,其神經(jīng)細胞接受多種神經(jīng)遞質的作用,通過激活相應受體引起心血管活動的改變。大鼠下丘腦室旁核存在IL-1β免疫陽性細胞及豐富的神經(jīng)纖維投射。放射自顯影方法發(fā)現(xiàn)大鼠各腦區(qū)均有散在分布的AngⅡ受體,其中室旁核神經(jīng)元是分布密度最大的核團之一。雖然在整體實驗中觀察到IL-1β對心血管活動的影響,但用電生理手段研究IL-1β對離體下丘腦室旁核神經(jīng)元放電活動的影響及其相關機制,國內外還未見報道。在本研究中,我們首先觀察了IL-1β對正常大鼠室旁核神經(jīng)元放電活動的影響,結果表明大鼠下丘腦室旁核的部分神經(jīng)元對IL-1β敏感,主要呈現(xiàn)興奮效應,潛伏期也很短,提示IL-1β對大部分室旁核神經(jīng)元的自發(fā)放電具有興奮作用。少數(shù)室旁核神經(jīng)元表現(xiàn)為抑制效應,可能是通過局部的神經(jīng)環(huán)路IL-1β擴散至鄰近的抑制性神經(jīng)元,使其興奮而導致抑制性遞質的釋放所致;也可能與室旁核神經(jīng)元細胞的類型有關。還有少數(shù)室旁核神經(jīng)元無明顯反應,可能意味著這些神經(jīng)元缺乏IL-1β作用相應的受體。我們在前期的實驗也顯示,在大鼠室旁核內微量注射IL-1β,出現(xiàn)明顯的血壓增高及心率增快反應,說明IL-1β作為神經(jīng)遞質或調質,對室旁核神經(jīng)元有緊張性激活作用。IL-1β對室旁核神經(jīng)元可能有多種作用途徑,并在機制上互相影響,互為因果。楊麗明等已證明,AngⅡ等多肽對同一室旁核神經(jīng)元作用時,發(fā)現(xiàn)有相當數(shù)量的神經(jīng)元可同時對其中兩種多肽起反應,提示室旁核神經(jīng)元可能是神經(jīng)內分泌和植物性功能調節(jié)的一個中樞整合部位。近年來,Ufnal等在側腦室注射AT1R阻滯劑,可消除中樞應用IL-1β引起的升壓反應,并認為這種作用的中樞部位可能是下丘腦的室旁核。我們曾觀察到IL-1β誘發(fā)的升壓效應部分是通過下丘腦室旁核AT1R介導的,同時IL-1β可以增加室旁核內AT1R的表達。本實驗在對IL-1β呈興奮反應的神經(jīng)元中用氯沙坦灌流后,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)元對IL-1β的興奮作用可被氯沙坦部分阻斷。由于氯沙坦是AT1R的特異性拮抗劑,與AT1R結合可抑制其激活而增加下丘腦神經(jīng)細胞的放電效應,提示AT1R可能參與了IL-1β對室旁核神經(jīng)元的興奮作用。Gurantz等研究證明IL-1β可通過激活NF-κB增加大鼠心肌AT1R的密度,Yoshida等報道IL-1β呈劑量依賴性刺激星形膠質細胞AT1R的表達增強。Cowling等認為中樞IL-1β能激活下丘腦神經(jīng)細胞NF-κB的表達,而轉錄因子NF-κB是誘導AT1RmRNA上調改變的必需因子;我們前期的實驗也顯示了側腦室給予IL-1β可使室旁核內AT1R蛋白增多,均與本實驗結果相呼應,并且相互解釋。IL-1β的最終效應不僅取決于對神經(jīng)元的直接作用,而且可能與該區(qū)心血管的血管緊張素系統(tǒng)調節(jié)機制有關,因此,IL-1β作為神經(jīng)遞質或調質對室旁核神經(jīng)元神經(jīng)細胞放電的影響,可能是通過下丘腦室旁核介導的發(fā)熱、厭食、對睡眠的調節(jié)以及對神經(jīng)內分泌及代謝的影響來實現(xiàn),特別是在應激性防御反應中起到了一定的作用,進一步說明IL-1β作為一種多效性細胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調控作用。1.3.2室旁核單位放電記錄及組織學定位:參考Paxinos和Watson圖譜,在解剖顯微鏡下用微電極推進器,將玻璃微電極(尖端直徑0.8～1.0μm,內充灌含有2%滂胺天藍的0.5mol/L醋酸鈉