液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中西替利嗪

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿中西替利嗪

鹽酸二甲酯是抗組胺藥物羥基二甲酯的活性羧酸衍生物。這是第二代抗組胺藥物羥基吡啶的選擇性抗劑。它對(duì)抗過(guò)敏效果很強(qiáng)，而且很持久。它可以抑制脂肪和大的細(xì)胞顆粒，抑制過(guò)敏反應(yīng)部分的移動(dòng)，并嘗試皮膚組織的浸潤(rùn)，沒(méi)有明顯的中間誘導(dǎo)副作用。西替利嗪是第一代H1受體羥嗪的活性羧酸代謝物,在體內(nèi)不易被細(xì)胞色素P450所代謝,大部分經(jīng)腎臟以原型藥物排出。目前已在國(guó)內(nèi)外獲準(zhǔn)上市,臨床主要用于防治(季節(jié)性和非季節(jié)性)過(guò)敏性鼻炎、慢性特發(fā)性蕁麻疹、過(guò)敏性哮喘、特異性皮炎等疾病。在此之前的研究中,測(cè)定人體內(nèi)西替利嗪的方法一般為高效液相色譜-紫外檢測(cè)或熒光檢測(cè),靈敏度低,達(dá)不到血漿中微量西替利嗪的檢測(cè)要求。此外紫外檢測(cè)缺乏特異性,不能完全排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。因此本文在前人的研究基礎(chǔ)上,建立了測(cè)定人體內(nèi)西替利嗪濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(HPLC-MS/MS),檢出限為0.50μg/L,并用于西替利嗪片劑在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究以及生物等效性研究。1實(shí)驗(yàn)部分1.1內(nèi)標(biāo)物:替米沙坦對(duì)照品,制備了馬立克氏鹽酸西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)040501):純度≥99.5%,浙江浙北藥業(yè)有限公司提供;內(nèi)標(biāo)物:替米沙坦對(duì)照品(批號(hào)030208):純度≥99.5%,北京德眾萬(wàn)全藥物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司提供;乙腈(色譜純,迪馬公司);水為重蒸去離子水;乙酸乙酯、CH2Cl2、枸櫞酸鈉、枸櫞酸均為分析純,由廣州市化學(xué)試劑廠提供。1.2高效液相色譜數(shù)據(jù)處理安捷倫1100LC/MSDXCT離子阱質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源及AgilentChemStations數(shù)據(jù)處理軟件,Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng);電子天平(瑞士SARTORIUS);XW-80A旋渦混合器(原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);高速離心機(jī)(美國(guó)MICRO12-24);真空干燥箱(德國(guó)MMM-GROUP)。1.3流動(dòng)相v乙腈v1%苯甲酸水色譜柱:AgilentZorbaxSB-C18(2.1mm×150mmi.d.,3.5μm);流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(1%甲酸水)=55∶45溶液;流速:0.5mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:5μL。1.4離子化模式離子源為電噴霧離子源(ESI);毛細(xì)管電壓(Capillary)5000V;毛細(xì)管出口電壓(CapillaryExit)113.5V;霧化氣壓力(Nebulizer):3.10×105Pa,干燥氣流量:9L/min,干燥氣溫度:350℃;離子化模式:正離子化(positive);掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。用于定量分析的離子分別為m/z389→201(西替利嗪)和m/z515→497(替米沙坦)。1.5標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制準(zhǔn)確稱取鹽酸西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)品適量(相當(dāng)于西替利嗪10.0mg),置于10mL容量瓶中,用V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液定容,即配制成1.0g/L的西替利嗪貯備液,貯存于4℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。試?yàn)前按試驗(yàn)所需稀釋成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。另配制100μg/L的內(nèi)標(biāo)替米沙坦乙腈溶液。1.6枸杞酸鈉溶液取含藥血漿0.5～10mL的帶塞磨口玻璃錐形離心管中,加入100μg/L的替米沙坦乙腈溶液50μL,快速振蕩3s,加入0.1mol/L枸櫞酸鈉水溶液(pH6)0.5mL,振蕩10s,再加入V(乙酸乙酯)∶V(CH2Cl2)=4∶1混合溶液3mL,密塞,旋渦振蕩2min,3500r/min下離心5min,吸取有機(jī)層置3mL的帶塞磨口玻璃錐形離心管內(nèi),37℃真空干燥箱中干燥至干。進(jìn)樣前加入V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液200μL,快速振蕩10s使殘?jiān)芙?3000r/min下離心5min,吸取上清液5μL進(jìn)樣。2結(jié)果與討論2.1峰:m/z39西替利嗪和內(nèi)標(biāo)物替米沙坦在電噴霧離子化方式下,主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z389和m/z515。對(duì)[M+H]+進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(見(jiàn)圖1),生成的主要碎片離子分別為m/z389→201(西替利嗪)和m/z515→497(替米沙坦),將這些主要碎片離子作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。2.2空白血漿樣品前處理分別取6名受試者的空白血漿0.5mL,分別按照上述的血漿樣品前處理操作,進(jìn)行分析。結(jié)果表明空白血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾西替利嗪及內(nèi)標(biāo)替米沙坦的測(cè)定。志愿者給藥后采集的血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖2。2.3回收率及精密度取空白血漿0.5mL共24份,分別加入0、25、50、100、500、1000、2000和4000μg/L的西替利嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL(1式3份),振蕩3s,使血漿藥物濃度相當(dāng)于0、2.5、5.0、10.0、50.0、100、200和400μg/L,然后按“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)處理。經(jīng)HPLC-MS/MS分析,以血漿西替利嗪質(zhì)量濃度(ρ)為縱坐標(biāo),藥物西替利嗪峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(F)為橫坐標(biāo),用最小二乘法進(jìn)行回歸分析,結(jié)果表明血漿中西替利嗪質(zhì)量濃度在2.50～400μg/L范圍呈良好的線性關(guān)系,回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為:ρ=44.04F+1.08,r=0.9993(n=7)。最低定量下限濃度為2.50μg/L,平行對(duì)濃度為2.50μg/L的6個(gè)含藥血漿樣品處理后進(jìn)行色譜分析,其提取回收率平均為97.3%,RSD為9.4%。檢出限為0.50μg/L(S/N=3)。2.4提取回收率測(cè)定按2.3節(jié)分別配制低(5.0μg/L)、中(200μg/L)和高濃度(300μg/L)的西替利嗪血漿溶液各15份,分為3批,每批5份,并與每批的標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),依“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)處理后進(jìn)行分析。同時(shí)將空白血漿,加入溶劑萃取處理后,再加入相應(yīng)濃度的西替利嗪和替米沙坦,按1.6節(jié)處理后,進(jìn)樣分析。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率,見(jiàn)表1。結(jié)果表明,本法的回收率穩(wěn)定,能滿足樣品分析的需要。2.5質(zhì)控樣品質(zhì)控按2.3節(jié)分別配制低(5.0μg/L)、中(200μg/L)、高濃度(300μg/L)的質(zhì)控樣品,每個(gè)濃度6樣品分析,分為兩組,每組每個(gè)濃度3個(gè)樣品?？疾炝藰悠贩謩e經(jīng)室溫放置24h和48h、-20℃下凍存7d和14d、凍融3次的穩(wěn)定性。不同濃度樣品檢測(cè)結(jié)果的RSD均小于15%。2.6血漿樣品檢測(cè)按2.3節(jié)分別配制低(5.00μg/L)、中(200μg/L)、高濃度(300μg/L)的血漿樣品置-20℃凍存?zhèn)溆?。檢測(cè)每批血漿樣品前需做隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線,并同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控樣品。結(jié)果表明隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品的偏差均在±15%內(nèi),符合體內(nèi)藥物分析要求,本試驗(yàn)血漿樣品的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。2.7靜脈血樣前處理經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選擇健康志愿者20名,空腹12h,分別口服西替利嗪10mg,于給藥前0h及給藥后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6,8,10,12及14h,經(jīng)靜脈留置針取前臂靜脈血5mL/次,4℃離心分離血漿,按“血漿樣品前處理”方法進(jìn)行色譜分析。將受試者單劑量試驗(yàn)后的血藥濃度列表并計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差,繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,如圖3所示。3樣品分析結(jié)果本文建立的LC-MS方法,采用MRM(多重反應(yīng)監(jiān)測(cè))掃描方式,同時(shí)對(duì)待測(cè)物的母離子和產(chǎn)物離子進(jìn)行檢測(cè),提高了方法的靈敏度和選