雌激素受體在小鼠下丘腦室旁核內(nèi)的表達(dá)

雌激素受體在小鼠下丘腦室旁核內(nèi)的表達(dá)

雌激素及其受體（estrog，er）參與大腦中各種重要功能的調(diào)節(jié)。ER-βmRNA和蛋白質(zhì)在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)具有腦區(qū)專一性,在不同的腦區(qū)其表達(dá)水平有差異,而且與另一種雌激素受體即ER-α的表達(dá)模式和生理意義也不盡相同。在小鼠,ER-β可能參與了對(duì)雄性小鼠攻擊行為的抑制和對(duì)空間記憶行為的調(diào)節(jié);還可能參與了神經(jīng)元的存活、遷移以及對(duì)情緒的調(diào)節(jié)。下丘腦的室旁核(paraventricularnucleus,PVN)是雌激素重要的靶器官之一。研究表明在正常動(dòng)物小鼠PVN,盡管也有ER-α的表達(dá),ER-β仍然是主要的雌激素受體,介導(dǎo)了雌激素對(duì)該核團(tuán)結(jié)構(gòu)與功能的直接調(diào)節(jié)。但是,PVN內(nèi)ER-β究竟參與了哪些功能的調(diào)節(jié)目前仍缺乏直接的證據(jù)。本研究應(yīng)用硫酸鎳銨增強(qiáng)的免疫組化顯色技術(shù)研究了妊娠以及哺乳過程中雌性小鼠PVN內(nèi)ER-β表達(dá)的變化,以期為深入研究ER-β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用提供形態(tài)證據(jù)。1免疫組化試驗(yàn)妊娠及哺乳期昆明小鼠購自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,以見陰栓出現(xiàn)之日為妊娠第0天,以此類推。取妊娠第8、10、12、15、18天以及分娩后第1、4、8天的母鼠40只,每時(shí)相點(diǎn)5只,經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后暴露胸腔、升主動(dòng)脈灌注4%多聚甲醛固定后,取腦入4%多聚甲醛-3.75%丙烯醛液后固定過夜,再浸入含30%蔗糖的溶液至組織塊沉底,20μm厚連續(xù)冰凍切片漂于PBS中備用。硫酸鎳銨增強(qiáng)顯色的免疫組化技術(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。兔抗ER-β多克隆抗體(Z8P)購自Zymed公司,已經(jīng)應(yīng)用Westernbloting、抗原肽預(yù)吸收實(shí)驗(yàn)、免疫沉淀及免疫組化等方法證明了該抗體的特異性,它能與小鼠、大鼠以及人源性ER-β蛋白特異性結(jié)合,與ER-α無交叉反應(yīng)。羊抗兔免疫組化試劑盒為SantaCruz產(chǎn)品(貨號(hào):2051),硫酸鎳銨為上海試劑二廠產(chǎn)品,DAB為Sigma分裝。切片經(jīng)1%牛血清白蛋白-2%H2O2(PBS配)處理20min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性,0.4%TritonX-100/0.1%牛血清白蛋白(PBS配)37℃孵育1h后于一抗(1∶1000;稀釋液為PBS含0.4%TritonX-100/2%正常血清)37℃孵育1h,再于4℃冰箱放置48h,二抗和S-P復(fù)合物(streptavidin-HRP)均于室溫孵育1h。顯色液配制:2.5%硫酸鎳銨-0.035%DAB-0.03%H2O2。對(duì)照試驗(yàn)以正常兔血清或無一抗的PBS代替ER-β一抗,其余操作同上。免疫染色反應(yīng)以相同倍率視野下陽性細(xì)胞的多少來確定。2妊娠和妊娠中er-免疫陽性細(xì)胞核的分布PVN可以分為大細(xì)胞部(magnocellulardivision,PaM)、小細(xì)胞部(parvocellulardivision,PaP)和背側(cè)帽部(dorsalcap,PaDC)等部位(圖1)。我們應(yīng)用ER-β多克隆抗體(Z8P)研究發(fā)現(xiàn),ER-β免疫陽性物質(zhì)主要見于小鼠的PVN以及終紋床核、杏仁內(nèi)側(cè)核、中縫背核等核團(tuán),本研究主要研究了PVN內(nèi)ER-β免疫陽性物質(zhì)的表達(dá)情況。研究表明,PVN內(nèi)ER-β分布并不均勻,主要集中在PaM,而在PaP較少,PaDC則更少。陽性物質(zhì)見于大多數(shù)陽性細(xì)胞的整個(gè)核內(nèi),但在個(gè)別時(shí)期,也可見免疫陽性細(xì)胞核的局部呈現(xiàn)陰性反應(yīng),但未見明顯的胞漿或突起著色。大多數(shù)陽性細(xì)胞染色很深,但也有一些淺染的細(xì)胞。妊娠第8天,可見較多的ER-β免疫陽性細(xì)胞核分散于PVN的PaM部,PaP部的陽性細(xì)胞數(shù)目較少,PaDC部基本上未見陽性細(xì)胞。妊娠第10天,可見少量的免疫陽性細(xì)胞均位于PaM部,其分布較為分散。PaP部和PaDC部均呈免疫陰性反應(yīng)(圖2)。妊娠第12天,PaM部的免疫陽性細(xì)胞更少,PaP部和PaDC部未見陽性細(xì)胞。妊娠第15天,ER-β免疫陽性細(xì)胞數(shù)目有所增加,接近第10天時(shí)的表達(dá)水平,但陽性細(xì)胞更集中在PaM部的中央。其余部位未見陽性細(xì)胞。妊娠第18天,免疫陽性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加,主要見于PaM的中部和尾部。PaP部只有散在的幾個(gè)陽性細(xì)胞,PaDC部未見陽性細(xì)胞。分娩后第1天,此時(shí)PaM部的ER-β免疫陽性細(xì)胞的數(shù)目、分布狀態(tài)與妊娠第18天時(shí)比較一致,ER-β免疫陽性細(xì)胞數(shù)目最多(圖3)。分娩后第4天,PVN內(nèi)ER-β免疫陽性細(xì)胞核數(shù)目較分娩后1天時(shí)減少,大約相當(dāng)于妊娠第15天的水平(圖4)。分娩后第8天,此時(shí)PVN內(nèi)ER-β免疫陽性細(xì)胞的分布模式均類似于分娩后第4天,陽性細(xì)胞數(shù)目略有減少。3pvn大細(xì)胞部神經(jīng)元內(nèi)er-和vp、vp的中介作用下丘腦室旁核神經(jīng)元主要分泌催產(chǎn)素(oxytocin,OT),也分泌其它一些神經(jīng)肽如加壓素(vasopressin,VP)、甘丙肽、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等,這些物質(zhì)被證明與應(yīng)激、能量代謝、生殖、生長、水平衡以及泌乳等有關(guān)。大鼠PVN內(nèi)ER-α的表達(dá)微弱甚至缺如,但是ER-βmRNA或蛋白表達(dá)水平很高,提示ER-β可能是PVN內(nèi)雌激素主要的功能性受體,介導(dǎo)了雌激素對(duì)該核團(tuán)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)。與在大鼠PVN內(nèi)的表達(dá)不一樣,小鼠PVN盡管主要表達(dá)ER-β,但是仍然檢測到ER-α的表達(dá),提示兩種ER都對(duì)小鼠PVN的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生影響。本實(shí)驗(yàn)研究了ER-β在妊娠以及哺乳過程中小鼠室旁核內(nèi)表達(dá)的變化,結(jié)果顯示在妊娠早期,PVN內(nèi)ER-β的表達(dá)較高,相當(dāng)于未孕成年小鼠時(shí)的表達(dá)水平;最高表達(dá)見于分娩前后很短的時(shí)間內(nèi)(妊娠第18天至生后1d),隨后(分娩后第4天)很快降低,并略低于未孕成年水平。我們還發(fā)現(xiàn),免疫陽性物質(zhì)主要位于PVN的大細(xì)胞部,在小細(xì)胞部和帽部只有零星的分布,表明即使在同一核團(tuán)內(nèi)ER-β的表達(dá)也存在細(xì)胞類型的差異性。既往研究表明,PVN內(nèi)ER-β的表達(dá)還存在種屬差異性,比如在大鼠PVN基本上只有ER-β的表達(dá),ER-α的表達(dá)非常微弱甚至沒有;而在小鼠PVN,盡管ER-β是主要的ER,但依然能檢測到ER-α的表達(dá);在綿羊PVN則以ER-α的表達(dá)為主。OT和VP是PVN內(nèi)主要的神經(jīng)肽,它們均由下丘腦PVN和視上核的大細(xì)胞部分泌(小鼠的視上核不表達(dá)ER-β)。OT通過調(diào)節(jié)子宮收縮參與了對(duì)正常分娩的調(diào)節(jié),還參與了對(duì)后代正常發(fā)育的調(diào)節(jié)。最近研究表明OT在改善經(jīng)產(chǎn)小鼠依賴于海馬的學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮了非常重要的作用。大量的研究表明雌激素對(duì)調(diào)節(jié)PVN大細(xì)胞部的OT與VP神經(jīng)元有著重要的功能,它能誘導(dǎo)PVN內(nèi)OTmRNA表達(dá)的增加,進(jìn)而啟動(dòng)分娩、泌乳、哺乳等母性行為。Alves等發(fā)現(xiàn)大鼠PVN內(nèi)有ER-β/OT、ER-β/VP共存于某些神經(jīng)元,其它文獻(xiàn)也有類似的報(bào)道?？偟膩碚f,PVN大細(xì)胞部神經(jīng)元內(nèi)ER-β與VP或OT免疫反應(yīng)性的共存表明雌激素能直接調(diào)節(jié)PVN內(nèi)上述神經(jīng)肽的分泌,從而對(duì)母性行為的誘發(fā)起到重要的作用。雖然目前還沒有關(guān)于小鼠PVN內(nèi)ER-β與OT或VP共存的研究報(bào)道,但也有證據(jù)表明在小鼠PVN,雌激素處理顯著升高OT而降低VP的表達(dá),而且雌激素的這種調(diào)節(jié)在敲除ER-β基因的小鼠則完全喪失,表明ER-β直接介導(dǎo)了雌激素對(duì)OT和VP的調(diào)節(jié)。已經(jīng)知道OT對(duì)分娩時(shí)子宮的收縮與母性行為的誘導(dǎo)非常重要,在分娩時(shí)檢測到高水平的OTmRNA和蛋白表達(dá)。本研究表明,在妊娠與哺乳過程中孕鼠PVN內(nèi)高水平的ER-β表達(dá)見于分娩前后較短的時(shí)間內(nèi),即妊娠第18天至生后1d,而且如前所述已發(fā)現(xiàn)在小鼠PVN內(nèi)ER-β介導(dǎo)了雌激素對(duì)OT的調(diào)節(jié),提示在分娩過程中雌激素可能通過ER-β的介導(dǎo)進(jìn)而調(diào)節(jié)OT的表達(dá)、最終對(duì)分娩以及母性行為發(fā)揮調(diào)控作用。但是,很有可能ER-β在調(diào)