抗苗勒管激素與抗苗勒管激素對小鼠顆粒細(xì)胞上卵刺激素受體mrna表達(dá)的影響

抗苗勒管激素與抗苗勒管激素對小鼠顆粒細(xì)胞上卵刺激素受體mrna表達(dá)的影響

由于卵巢衰竭，女性的更年期發(fā)育導(dǎo)致閉經(jīng)、卵巢萎縮、卵巢刺激素增多和雌激素水平下降。這是一種嚴(yán)重影響女性身心健康的卵巢功能低下疾病。臨床表現(xiàn)見不同程度的潮熱多汗、陰道干澀、性欲下降等絕經(jīng)前后癥狀,并且導(dǎo)致患者骨質(zhì)疏松、心血管疾病等絕經(jīng)后疾病提前發(fā)生,該病發(fā)病率占成年女性的1%~3%,發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來卵巢局部調(diào)控因子成為研究的熱點(diǎn),抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)是重要的卵巢局部調(diào)控因子之一,AMH與顆粒細(xì)胞上卵泡刺激素受體(follicle-stimulatinghormonereceptor,FSHR)的關(guān)系成為關(guān)注的問題。2010年10月至2011年6月本實(shí)驗(yàn)通過體外分離培養(yǎng)小鼠原代顆粒細(xì)胞,加入不同濃度的AMH于培養(yǎng)液中,觀察各組間顆粒細(xì)胞上FSHRmRNA的表達(dá)情況。報(bào)告如下。1材料和方法1.1小鼠和小鼠抗小鼠抗體孕馬血清促性腺激素(寧波第二激素廠),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國HyClone公司),無支原體胎牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司),胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司),FHSR山羊抗小鼠抗體(SantaCruzBiotechnology),熒光PE標(biāo)記二抗,Trizol,5×逆轉(zhuǎn)錄buffer,5×SYBRGreenⅠPCRbuffer,dNTPs,MMLV,Taq酶;CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO),低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)體視顯微鏡(德國Leica公司),普通光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS),ABI3900臺式高通量DNA合成儀,ABI9700PCR儀,ABI7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5~7周的SPF級昆明雌性小鼠,體重18~22g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3方法1.3.1組織病理學(xué)觀察選15只5~7周的昆明雌性小鼠,每只小鼠注射15~20單位的孕馬血清促性腺激素,48~54h后頸椎脫臼法處死。處死后的小鼠放入75%的酒精中浸泡1~2min后,解剖取雙側(cè)卵巢,把卵巢立即放入預(yù)冷的無菌PBS中,用無菌PBS沖洗3遍,在解剖顯微鏡下剔除卵巢上的包膜、脂肪組織,再用PBS洗2~3遍,在解剖顯微鏡下用1號針頭刺破卵泡,釋放顆粒細(xì)胞。把卵巢組織和混有顆粒細(xì)胞的PBS液放入離心管中,1000r/min離心5min后棄上清液,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸懸浮細(xì)胞,放入培養(yǎng)皿中,加含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸到4mL,用吸管輕輕吹打分散細(xì)胞,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化30min,期間吹打2~3次。消化完畢后用含胎牛血清的全培養(yǎng)基終止消化,1000r/min離心5min,棄上清液,用全培養(yǎng)基(85mLDMEM/F12+15mL胎牛血清+1mL青-鏈霉素)懸浮,制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞稀釋成1×106·mL-1的細(xì)胞懸液,接種于6孔板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),36~48h后第1次換液,以后隔天換一次培養(yǎng)基。1.3.2小鼠細(xì)胞抗能力檢測(1)形態(tài)學(xué)觀察:在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征并拍照;(2)FSHR表達(dá)鑒定顆粒細(xì)胞的純度:取生長旺盛的第4天的細(xì)胞,倒掉培養(yǎng)基,用無菌PBS洗3遍,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸消化5~10min,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的變化,待大部分細(xì)胞變圓形后立即加入含胎牛血清的全培養(yǎng)基終止消化,1000r/min離心5min后棄上清液,加入PBS制成1×106·mL-1的細(xì)胞懸液,分成兩管,實(shí)驗(yàn)管中加入FSHR山羊抗小鼠抗體和二抗羊抗鼠IgG-FITC,對照組只加二抗,室溫下孵育30min,上機(jī)檢測;(3)免疫熒光鑒定顆粒細(xì)胞:細(xì)胞爬片后,用4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮),PBS漂洗2次,5min/次,然后用1%BSA封閉30min,再加入1%BSA稀釋的一抗FSHR山羊抗小鼠抗體(1∶200),于37℃雜交2h后,PBS漂洗2次,5min/次,加入1%BSA稀釋的二抗IgG-PE,于37℃雜交1h,PBS漂洗2次,5min/次,最后用5μg/mLDAPI染色2min,用抗淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.3.3加入不同濃度的amh,并以推動(dòng)各施細(xì)胞的表達(dá)為前提將細(xì)胞制成1×106·mL-1的細(xì)胞懸液,接種于6孔板中,每孔種2mL,培養(yǎng)24h后換液,并加入不同濃度的AMH,分組如下:(1)空白對照組;(2)AMH5ng/mL組;(3)AMH10ng/mL組;(4)AMH20ng/mL組;(5)AMH30ng/mL組;(6)AMH40ng/mL組。每組重復(fù)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后,取出后做熒光定量PCR的檢測。1.3.4rna的純化、鑒定與引物的合成(1)總RNA的提取:將已加入Trizol的細(xì)胞液充分振蕩混勻,加入氯仿0.2mL,蓋緊蓋子,用力搖動(dòng)15s,15~30℃孵育2~3min,4℃12000r/min離心15min,取上清液至新的1.5mLEppendorf管,加與上清液等體積的異丙醇,15~30℃孵育樣品10min,4℃12000r/min離心10min,棄上清液,75%乙醇(含DEPC水)洗滌沉淀1次(至少1mL75%乙醇/mLTrizol),4℃7500r/min離心5min,棄乙醇,空氣或真空干燥5~10min(不要完全干燥),加DEPC處理水溶解RNA,-80℃保存?zhèn)溆?。取一部分樣品靜紫外分光光度計(jì)測RNA的純度,測定OD260/280>1.8,表明純度合格。取部分樣品進(jìn)行電泳分析,測定RNA是否降解;(2)引物的設(shè)計(jì)與合成:GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,用Primerexpress2.0軟件設(shè)計(jì)引物,ABI3900臺式高通量DNA合成儀合成引物。FSHRmRNA引物(序列號NM013523),上游引物:5′-ATCCACATCATTGCCAGGAACTC-3′,下游引物:5′-GGTTCCGTTGAATGCACAGTTG-3′;內(nèi)參GAPDH引物(序列號NM008084),上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游引物:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′;(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):取4μLRNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),儀器為ABI9700儀(美國ABI公司),反應(yīng)體系含如下成分:5×逆轉(zhuǎn)錄buffer、引物、dNTPs(10mmol/L)、MMLV(200U/μL)、DEPC水、RNA模板,反應(yīng)總體積20μL,反應(yīng)條件為37℃1h,然后95℃3min;(4)待測樣本反應(yīng)體系:5×SYBRGreenⅠ、PCRbuffer、上下游引物(10pmol/μL)、dNTPs(10mmol/L)、Taq酶(3U/μL)、cDNA,反應(yīng)總體積50μL,反應(yīng)條件為:93℃3min,然后93℃30s,55℃45s,72℃45s,共40循環(huán)。1.4統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。2結(jié)果2.1細(xì)胞貼壁生長剛種入培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞呈圓形或橢圓形,顆粒細(xì)胞單層貼壁生長,貼壁后的顆粒細(xì)胞形態(tài)完整,呈梭形或多角形。24h后細(xì)胞開始貼壁生長(圖1-A);48h見細(xì)胞貼壁良好,并有明顯的增殖,生長旺盛(圖1-B);72h后細(xì)胞生長極度旺盛(圖1-C)。2.2胞胞漿檢測結(jié)果FSHR由卵巢顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)于細(xì)胞胞漿,細(xì)胞檢測的結(jié)果見圖2,共檢測了10000個(gè)細(xì)胞,表達(dá)FSHR的細(xì)胞共8383個(gè),占83.83%。2.3紅蘇葉紅松林紅酵母染色FSHR為卵巢顆粒細(xì)胞的特異性表達(dá)受體,FSHR陽性染色定位于胞漿,紅色熒光為FSHR陽性表達(dá)(圖3-A),藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核(圖3-B),圖3-C為FSHR和細(xì)胞核染色共顯圖。2.4pcr中的熒光定量結(jié)果2.4.1凝膠成像儀電泳每組分別跑3個(gè)泳道,進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀記錄電泳結(jié)果。如圖4,可清晰見到28S、18S條帶,5S條帶亦可見到,說明RNA未降解,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.4.2amh對fshrna表達(dá)的影響濃度5和10ng/mL組FSHRmRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),其他組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但隨著AMH濃度提高FSHRmRNA表達(dá)呈下降趨勢,見表1。說明AMH與FSHRmRNA的表達(dá)存在一定的拮抗關(guān)系。3amh在卵巢發(fā)育中的表達(dá)卵巢功能調(diào)節(jié)除了傳統(tǒng)的內(nèi)分泌軸調(diào)節(jié)外,以卵巢旁分泌調(diào)節(jié)是重要的調(diào)節(jié)途徑之一。卵巢顆粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種卵巢局部調(diào)控因子,并能促進(jìn)卵泡的生長、卵母細(xì)胞成熟,在卵泡的發(fā)育中起著重要的作用。而作為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一的AMH是重要的卵巢局部調(diào)控因子之一,其主要由竇前卵泡和小竇卵泡(直徑≤4mm)的顆粒細(xì)胞分泌,能夠抑制卵泡的起始募集,阻止卵泡由靜止階段進(jìn)入生長階段,另外一個(gè)重要的作用是能夠降低生長卵泡對FSH的敏感性。FSH是由垂體分泌的一種糖蛋白激素,主要作用是促進(jìn)顆粒細(xì)胞增生分化,并通過與卵泡表面的FSHR結(jié)合從而發(fā)揮調(diào)節(jié)卵泡作用,而AMH能夠拮抗FSH對卵泡生長的促進(jìn)作用。有報(bào)道提示AMH通過抑制FSH依賴的芳香化酶活性從而降低FSH敏感性,AMH與FSH的這種關(guān)系是否亦通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞上的FSHR來實(shí)現(xiàn),對進(jìn)一步闡明AMH作用機(jī)制以及指導(dǎo)臨床用藥具有重要價(jià)值。AMH是分子量為140kD的二聚體糖蛋白,與抑制素(inhibins)、活化素(activins)、骨形態(tài)形成蛋白(BMPs)、生長分化因子(GDFS)等共同構(gòu)成TGF-β超家族,與TGF-β家族其他成員的廣泛表達(dá)不同,AMH的表達(dá)僅限于性腺,參與卵泡生長發(fā)育。人類卵巢中AMH于妊娠36周開始表達(dá),這個(gè)時(shí)間苗勒氏管已經(jīng)對AMH失去敏感性。青春期后AMH血清濃度達(dá)到高峰,并持續(xù)整個(gè)生育年齡,然而在女性整個(gè)生育年齡,其濃度較低,絕經(jīng)后檢測不到。在雌性小鼠,AMH于出生后開始表達(dá)于生長卵泡的顆粒細(xì)胞中,始基卵泡的前顆粒細(xì)胞不表達(dá),當(dāng)始基卵泡募集進(jìn)入生長池,顆粒細(xì)胞開始表達(dá)AMH,在次級卵泡、竇前卵泡和≤4mm的小竇狀卵泡中表達(dá)較高,而在大的竇前卵泡和小的竇狀卵泡(直徑≤4mm)中表達(dá)水平最高,主要由卵丘顆粒細(xì)胞而非壁顆粒細(xì)胞產(chǎn)生,在直徑4~8mm的竇狀卵泡中則幾乎無AMH表達(dá)。研究表明,AMH在竇狀卵泡之后的階段以及閉鎖卵泡、膜細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵巢間質(zhì)細(xì)胞中均不表達(dá)。由于AMH與整個(gè)卵泡的生長發(fā)育過程密切相關(guān),因此被很多研究認(rèn)為是反映卵巢儲備的最佳指標(biāo),學(xué)者們也進(jìn)行了各種臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究探討AMH在卵巢相關(guān)疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)和POF中所扮演的角色,以求進(jìn)一步揭示此類卵巢相關(guān)疾病的病因或探討AMH在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。事實(shí)上,大部分PCOS或POF患者的病因目前尚不清楚。以POF為例,據(jù)SHELLING報(bào)道,35%POF患者是由于自身免疫、家族遺傳或者X染色體異常引起,而高達(dá)65%的該病患者是病因未明的,目前認(rèn)為卵巢早衰發(fā)生的可能機(jī)制與卵巢內(nèi)始基卵泡形成數(shù)目的減少、已形成的卵泡閉鎖速度加快時(shí)卵巢過早失去卵泡池有關(guān);同時(shí),卵泡細(xì)胞膜上FSH受體減少或功能異常對FSH的刺激不敏感而致卵泡停止生長。而KALU等的研究顯示1%~3%女性受到POF困擾,因此揭示POF病因?qū)τ谂R床實(shí)踐無疑具有重要意義。已有研究提示,AMH通過抑制FSH依賴的芳香化酶活性,降低卵泡對FSH的敏感性,從而抑制卵泡的生長。而FSH發(fā)揮卵泡調(diào)節(jié)作用與其受體FSHR密不可分,因此本實(shí)驗(yàn)試圖探討AMH是否亦通過影響FSHR而抑制FSH的敏感性。我們的研究結(jié)果顯示,通過測定在不同濃度的AMH培養(yǎng)基中顆粒細(xì)胞上FSHRmRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)當(dāng)AMH濃度為5ng/mL時(shí),顆粒細(xì)胞上FSHRmRNA的表達(dá)量最高,AMH濃度逐漸增高時(shí),FSHRmRNA的表達(dá)則逐漸降低,提示AMH的濃度與FSHRmRNA的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)趨勢,說明AMH與FSH的拮抗關(guān)系與AMH拮抗顆粒細(xì)胞上FSHRmRNA的表達(dá)有關(guān)。POF患者血清中FSH值升高,但卵巢中幾乎沒有卵泡發(fā)育,表明卵巢早