生物傳感器的研究與應(yīng)用

生物傳感器的研究與應(yīng)用

0微生物電極傳感器生物傳感器是一種多學(xué)科的綜合集成技術(shù)，在科學(xué)研究、工業(yè)生產(chǎn)甚至人們生活中發(fā)揮著重要作用。在最初15年里,生物傳感器主要以酶作為敏感材料,但是,由于酶的價(jià)格昂貴,且性能又不夠穩(wěn)定,所以,其應(yīng)用受到一定的限制。近些年來(lái),隨著微生物固定化技術(shù)地不斷發(fā)展,各類新型生物傳感器不斷涌現(xiàn),產(chǎn)生了微生物電極傳感器。微生物電極以微生物活體作為分子識(shí)別敏感物質(zhì),能快速、準(zhǔn)確地測(cè)量物理、化學(xué)和生物量,在環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)研究、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等方面得到廣泛的應(yīng)用。目前,光纖生物傳感器的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛,而且,隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polyerasechainreaction,PCR)技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用PCR的DNA生物傳感器也越來(lái)越多。20世紀(jì)80年代初,新興起一種表面等離子體共振(surfaceplasmonresonce,SPR)技術(shù)將生物傳感器的發(fā)展推向一個(gè)新的階段。1電化學(xué)傳感器主要作用機(jī)理生物傳感器是以固定化的生物成分(酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)或生物體本身(細(xì)胞、微生物、組織等)為敏感材料、與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器相結(jié)合產(chǎn)生的一種快速檢測(cè)各種物理、化學(xué)和生物量的器件。它通過(guò)各種物理、化學(xué)換能器捕捉目標(biāo)物與敏感材料之間的反應(yīng),然后,將反應(yīng)的程度轉(zhuǎn)變成電信號(hào),根據(jù)電信號(hào)推算出被測(cè)量的大小。敏感材料是對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行選擇性作用的生物活性單元。最先被使用的是具有高度選擇催化活性的酶。酶或是以物理方法(包埋、吸附等),或是以化學(xué)方法(交聯(lián)、聚合等)被固定在化學(xué)傳感器的敏感膜中,然后,以化學(xué)電極作為換能器測(cè)定酶催化目標(biāo)物反應(yīng)所生成的特定產(chǎn)物的濃度,從而間接地測(cè)定目標(biāo)物的濃度。隨著物理檢測(cè)手段的引入,人們已成功地把抗體、DNA聚合物、核酸、細(xì)胞受體和完整細(xì)胞等具有特異選擇性作用功能的生物活性單元用作了敏感材料。換能器是能捕捉敏感材料與目標(biāo)物之間的作用過(guò)程的器件。最早應(yīng)用的換能器就是前面所提到的電化學(xué)傳感器。這類換能器既可以是電位型的也可以是電流型的,所不同的是前者測(cè)量零電流下電極表面的電荷密度變化,后者測(cè)量恒定電壓下工作電極在反應(yīng)過(guò)程中的電流變化。2生物傳感器技術(shù)的發(fā)展1962年,Clark在紐約自然科學(xué)學(xué)會(huì)的論文集中首次提出了“在化學(xué)電極的敏感膜中加入酶以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行選擇性分析”的設(shè)想。1967年,Updike等人把葡萄糖氧化酶固定化膜和氧電極組裝在一起,制成了第一代生物傳感器。經(jīng)過(guò)40年地不斷發(fā)展,隨著研究的深入,各種物理手段不斷地被引入到生物傳感器,當(dāng)今的生物傳感技術(shù)日新月異。1975年,熱酶探針(thermalenzymeprobe)和酶熱敏電阻器(tnzymethermistor)分別研制成功。1980年,在光學(xué)傳感器—光極(optode)的基礎(chǔ)上,Lubbers等人研制成了測(cè)量乙醇的光學(xué)生物傳感器。這些換能器都是通過(guò)測(cè)定生化反應(yīng)中的產(chǎn)物、熱效應(yīng)或是光效應(yīng)而間接地測(cè)定目標(biāo)物的。20世紀(jì)70年代起,人們就開始尋求一種可以直接捕捉敏感源與目標(biāo)物之間結(jié)合過(guò)程(如,抗體與抗原的結(jié)合)的換能器。直到1983年,Leiberg等人發(fā)表了一篇采用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)親合反應(yīng)的報(bào)道后,這一問(wèn)題才得到解決,這一技術(shù)隨即促成了免疫傳感器的產(chǎn)生。另外,在酶電極中還廣泛應(yīng)用著一種促進(jìn)酶活性中心與電極表面之間電子轉(zhuǎn)移的物質(zhì)——介體(mediator)。1976年,可溶性的六氰合鐵酸鹽首次被作為介體加入敏感膜中充當(dāng)酶與電極之間的電子傳遞劑,以提高傳感器的性能?，F(xiàn)在,介體已廣泛應(yīng)用于電流型酶電極制作中。Medisense公司繼續(xù)以研發(fā)第一代酵素電極為主,1984年,Turner等人報(bào)道了用二茂鐵及其衍生物作為氧化還原酶的介體以制造廉價(jià)酶電極的方法。很快MediSense公司便以此為基礎(chǔ)發(fā)展了能大規(guī)模生產(chǎn)具有高重現(xiàn)性酶電極的絲網(wǎng)印刷技術(shù),該技術(shù)推動(dòng)了生物傳感器的發(fā)展。20世紀(jì)90年代初,生物傳感器的研究進(jìn)入第二階段,這時(shí)期的生物傳感器為第二代。第二代生物傳感器的特點(diǎn)是使用抗體或受體蛋白作分子識(shí)別組件,換能器的選用則更為多樣化,諸如場(chǎng)效應(yīng)管(FET),光纖(FOS),壓電晶體(PZ),聲表面波(SAW)器件等。目前,第二代的生物傳感器的代表產(chǎn)品為1991年上市的瑞典商家Pharmacia所推出的BIAcore與BIAlite兩項(xiàng)產(chǎn)品。1996年,Turner等人研制的一種以DNA為敏感源的傳感器,利用液晶分散技術(shù),將DNA聚陽(yáng)離子配合物固定在換能器上,所有能影響DNA分子間交聯(lián)度的化學(xué)和物理因素均能被靈敏地捕獲,并反映為一個(gè)強(qiáng)的、具有“指紋”結(jié)構(gòu)的圓二色譜吸收峰。21世紀(jì)發(fā)展的生物傳感器為第三代產(chǎn)品,隨著微加工技術(shù)和納米技術(shù)的進(jìn)步,生物傳感器不斷地向微型化、集成化方向發(fā)展,便攜式測(cè)試儀已得到快速發(fā)展。過(guò)去4年中,生物傳感器研發(fā)的方向有了顯著變化,許多新的生物技術(shù)的出現(xiàn),如,生物表達(dá)化學(xué)、表面定性、分子標(biāo)記以及納米科技,帶動(dòng)了生物傳感器在各種環(huán)境下應(yīng)用的增長(zhǎng)。當(dāng)今,納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用,使其研究進(jìn)入嶄新階段。納米顆粒對(duì)酶生物傳感器的敏感性有增強(qiáng)作用,酶電極的性能是由酶的催化活性、酶活性中心和電極表面之間電子交換速率決定的。納米顆粒比表面積大、表面自由能高,吸附能力較強(qiáng),使更多的酶分子可以固定在納米顆粒表面。另外,由于納米顆粒尺寸很小,有可能與酶內(nèi)部的親水基團(tuán)發(fā)生作用,從而引起酶構(gòu)型上的變化。這種變化使得酶的活性中心更接近底物,提高了酶的催化效率。比如:納米Au顆粒是電的良導(dǎo)體,具有很好的生物相容性,而改性納米SiO2顆粒對(duì)生物分子又具有很好的選擇吸附性。因此,可望實(shí)現(xiàn)納米Au和SiO2顆粒與酶分子活性中心及電極表面之間的直接電化學(xué)作用,大大增強(qiáng)生物傳感器的靈敏度。在生物傳感器研究領(lǐng)域內(nèi),集納米技術(shù)、生物技術(shù)和自組裝方法于一體,實(shí)現(xiàn)具有高酶活性的三維有序組裝制備生物傳感器的報(bào)道不多。從已有的一些報(bào)道來(lái)看,加入納米粒子后制備的生物傳感器的靈敏度得到了很大提高。響應(yīng)時(shí)間的縮短,檢測(cè)的線性范圍的增大,都表明了生物傳感器性能的提高。Morrin等人基于可加工的傳導(dǎo)聚苯胺納米顆粒制成了生物傳感器。國(guó)內(nèi)外學(xué)者還對(duì)納米顆粒增強(qiáng)葡萄糖氧化酶(GOD)生物傳感器開展了大量研究。結(jié)果表明:葡萄糖生物傳感器具有選擇性高、測(cè)試簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn),是檢測(cè)葡萄糖濃度最常用的方法。人的血液和體液中含有許多干擾物質(zhì),通過(guò)引入納米顆粒,還可以改善葡萄糖傳感器抗干擾性能。我國(guó)生物傳感器研究始于20世紀(jì)80年代初,20世紀(jì)90年代是我國(guó)生物傳感器應(yīng)用取得較大發(fā)展的10年,山東省科學(xué)院生物研究所是國(guó)內(nèi)首家在該方面研究開發(fā)取得成功的單位,從1983年到1998年已研制成功了10多項(xiàng)產(chǎn)品,有的成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。以SBA-40型和50型生物傳感分析儀為代表,儀器集成了許多智能化操作程序,其主程序可方便地滿足多種自動(dòng)測(cè)定要求。具有多酶協(xié)同作用的復(fù)合酶膜生物傳感器,通過(guò)自動(dòng)測(cè)定程序?qū)崿F(xiàn)了糖化酶活性的快速自動(dòng)測(cè)量,應(yīng)用雙電極差分的方法實(shí)現(xiàn)了難以分析的生化樣品測(cè)定,包括尿素、谷氨酰胺、淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖等。在20世紀(jì)90年代中期,生物傳感分析儀品種得到更新?lián)Q代,還建立了相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。3生物傳感器的應(yīng)用研究[11、12、13、14、15、16、17、18、19和20]3.1生物傳感器技術(shù)生物傳感器在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重大的作用。生物傳感技術(shù)不僅為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷提供了一種快速簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)方法,而且,因其專一、靈敏、響應(yīng)快等特點(diǎn),在軍事醫(yī)學(xué)方面,也具有廣闊的應(yīng)用前景。在臨床醫(yī)學(xué)中,酶電極是最早研制且應(yīng)用最多的一種傳感器。利用具有不同生物特性的微生物代替酶,可制成微生物傳感器。免疫傳感器等生物傳感器可用來(lái)檢測(cè)體液中的各種化學(xué)成分,為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)。在軍事醫(yī)學(xué)中,對(duì)生物毒素地及時(shí)、快速檢測(cè)是防御生化武器的有效措施,生物傳感器除用于監(jiān)測(cè)多種細(xì)菌、病毒及其毒素,還可以用來(lái)測(cè)量乙酸、乳酸、乳糖尿酸、抗生素、谷氨酸等各種氨基酸,以及各種致癌物質(zhì)。生物傳感器技術(shù)的不斷進(jìn)步,必然要求不斷降低產(chǎn)品成本,提高靈敏度、穩(wěn)定性和延長(zhǎng)使用壽命。這些特性的改善也會(huì)加速生物傳感器市場(chǎng)化、商品化的進(jìn)程。1975年,YellowSpringsInstrument公司首次成功地將葡萄糖酶電極推向市場(chǎng)。1976年,Miles公司將酶電極用于人造胰臟中的血糖監(jiān)控。1987年,MediSense公司推出絲網(wǎng)印刷電極。1990年,Pharmacia公司將SPR技術(shù)市場(chǎng)化。目前,Quantech公司也正準(zhǔn)備以SPR技術(shù)為基礎(chǔ)推出一系列用于診斷早期心肌梗塞的儀器。據(jù)KaloramaInformation近日發(fā)布的一項(xiàng)新研究報(bào)告《醫(yī)療與生物傳感器和傳感器系統(tǒng):市場(chǎng)、應(yīng)用和全球競(jìng)爭(zhēng)》稱,2005年,生物傳感器營(yíng)業(yè)收入達(dá)到了29億美元,而醫(yī)療應(yīng)用占該銷售額的最大份額。3.2發(fā)酵工業(yè)生物傳感器的應(yīng)用和復(fù)配在微生物發(fā)酵過(guò)程中,檢測(cè)多種有關(guān)的生化參數(shù)(生物量/細(xì)胞活性、底物/營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)物/代謝物),是生物技術(shù)領(lǐng)域研究者和工程師們有效地對(duì)過(guò)程進(jìn)行控制的必要前提。在各種生物傳感器中,微生物傳感器最適合發(fā)酵工業(yè)諸多化學(xué)、生物參數(shù)的測(cè)定。因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中常存在對(duì)酶的干擾物質(zhì),并且,發(fā)酵液往往不是清澈透明的,不適用于光譜等方法測(cè)定。而應(yīng)用微生物傳感器則極有可能消除干擾,并且,不受發(fā)酵液混濁程度的限制。同時(shí),由于發(fā)酵工業(yè)是大規(guī)模的生產(chǎn),微生物傳感器成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單的特點(diǎn)使其在應(yīng)用中具有更大的優(yōu)勢(shì)。生物傳感器類分析儀器得到普及應(yīng)用,改變了我國(guó)在發(fā)酵控制分析儀器方面的落后面貌。我國(guó)研發(fā)的生物傳感器分析儀具有方便、快速、精確、容易操作、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。3.3糖酸糖的檢測(cè)生物傳感器在食品分析中的應(yīng)用包括食品成分、食品添加劑、有害毒物及食品鮮度等的測(cè)定分析。食品成分分析:在食品工業(yè)中,葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和貯藏壽命的一個(gè)重要指標(biāo)。已開發(fā)的酶電極型生物傳感器可用來(lái)分析白酒、蘋果汁、果醬和蜂蜜中葡萄糖的含量。食品添加劑的分析:亞硫酸鹽通常用作食品工業(yè)的漂白劑和防腐劑,采用亞硫酸鹽氧化酶為敏感材料制成的電流型二氧化硫酶電極可用于測(cè)定食品中的亞硫酸含量。此外,也用生物傳感器測(cè)定色素和乳化劑。3.4玻璃碳極上生物傳感器大氣環(huán)境監(jiān)測(cè)中,SO2是酸雨酸霧形成的主要原因,傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很復(fù)雜。Marty等人將亞細(xì)胞類脂類固定在醋酸纖維膜上,和氧電極制成安培型生物傳感器,可對(duì)酸雨和酸霧樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。生化需氧量(biochemicaloxygendemand,BOD)的測(cè)定是監(jiān)測(cè)水體被有機(jī)物污染狀況的最常用指標(biāo),常規(guī)的BOD測(cè)定需要5天的培養(yǎng)期,操作復(fù)雜、重復(fù)性差、耗時(shí)耗力、干擾性大,不宜現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。目前,研究人員分離了2種新的酵母菌種SPT1和SPT2,并將其固定在玻璃碳極上以構(gòu)成微生物傳感器,用于測(cè)量BOD,其重復(fù)性誤差為±10%。該傳感器用于紙漿廠污水中BOD的測(cè)定,其測(cè)量最小值可達(dá)2mg/L,所用時(shí)間為5min。用耐高滲透壓的酵母菌種作為敏感材料的一種新型微生物傳感器,在高滲透壓下可以正常工作,并且,其菌株可長(zhǎng)期干燥保存,浸泡后即恢復(fù)活性,為海水中BOD的測(cè)定提供了快捷簡(jiǎn)便的方法。除微生物傳感器外,一種光纖生物傳感器已經(jīng)研制出來(lái),用于測(cè)定河水中較低的BOD值,該傳感器的反應(yīng)時(shí)間是15min,最適工作條件為30℃,pH=7,傳感器系統(tǒng)幾乎不受氯離子的影響(在1000mg/L范圍內(nèi)),并且,不被重金屬(Fe3+,Cu2+,Mn2+,Cr3+,Zn2+)所影響,該傳感器已經(jīng)應(yīng)用于河水BOD的測(cè)定,并且,獲得了較好的結(jié)果。將BOD生物傳感器經(jīng)過(guò)光處理(即以TiO2作為半導(dǎo)體,采用6W燈照射約4min)后,靈敏度將大大提高,適用于河水中較低BOD的測(cè)量。一種緊湊的光學(xué)生物傳感器也已經(jīng)研制成功,能同時(shí)測(cè)量多種樣品的BOD值,它使用3對(duì)發(fā)光二極管和硅光電二極管,假單胞細(xì)菌(pseudomonasfluorescens)用光致交聯(lián)的樹脂固定在反應(yīng)器的底層,該測(cè)量方法既迅速又簡(jiǎn)便,在4℃下可使用6周,已被用于工廠廢水處理。隨著生物傳感器在食品、醫(yī)藥、環(huán)境和過(guò)程監(jiān)控等方面應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,要求傳感器既不干擾測(cè)定對(duì)象而又不被測(cè)定對(duì)象中的其他相關(guān)組分影響,要滿足這一要求,同時(shí)又能得出高精度的測(cè)量結(jié)果,不能只依靠對(duì)敏感元件的改進(jìn),而需要建立一套一體化、微型化的優(yōu)化系統(tǒng)(包括進(jìn)樣、處理和測(cè)量)才能得到滿意的結(jié)果。4生物醫(yī)用納米傳感器的發(fā)展趨勢(shì)生物傳感器是極具有發(fā)展?jié)摿Φ膶W(xué)科領(lǐng)域,作為知識(shí)經(jīng)濟(jì)的新增長(zhǎng)點(diǎn),它將促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和常規(guī)生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,可為許多經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域提供不可缺少的信息。新的快速分析方法、新的生物儀器設(shè)備的來(lái)源