一種柑橘褐斑病細(xì)菌的分離鑒定及其對農(nóng)藥的敏感性

一種柑橘褐斑病細(xì)菌的分離鑒定及其對農(nóng)藥的敏感性

唐方橙色是云南省馬關(guān)縣的晚熟食品品種，在春節(jié)前1個月和2個月成熟。該品種果實扁圓形,平均單果重25g,最大果重49g。成熟后顏色鮮黃,皮薄緊繃,清香味濃,是當(dāng)?shù)靥赜衅贩N。近10a來,塘坊橘已成為云南省馬關(guān)縣調(diào)整農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中的一個新的經(jīng)濟增長點,至2007年底,塘坊橘的種植面積發(fā)展到約584hm2,總產(chǎn)量達(dá)950t,總產(chǎn)值達(dá)344萬元。隨著種植規(guī)模的擴大和種植時間的延長,由原來粗放管理改為園藝式的集約化栽培。由于栽培生態(tài)的變化和感病寄主的增加,致使柑橘病害隨之逐年加重。自2007~2008年始柑橘褐斑病大規(guī)模流行。該病春季危害幼葉和幼果,夏、秋季節(jié)侵害各階段果實和葉子,導(dǎo)致大面積落葉、落果,產(chǎn)量急劇下降,整個地區(qū)柑橘產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響,2008年較上年減收約200萬元,而且有逐年惡化的趨勢,成為生產(chǎn)上亟待解決的難題。2009年下半年,對柑橘褐斑病進行了系統(tǒng)的研究,現(xiàn)報道病原菌的分離鑒定及藥物篩選的結(jié)果。1材料和方法1.1分離方法及培養(yǎng)方供試分離的柑橘樣品隨機采自馬關(guān)塘坊鎮(zhèn)的幾個桔園,共選33個病果。分離方法參考方中達(dá)植病研究方法進行分離培養(yǎng)。采用單孢分離法,純化所得到的菌株;不產(chǎn)孢者采用玻璃珠搖瓶方法多次進行菌絲片段的平板涂布。將純化的菌株編號后轉(zhuǎn)管于PDA培養(yǎng)基,保存在4℃冰箱內(nèi)待鑒定。1.2重新結(jié)和細(xì)菌菌株的確定利用健康無損的生長期果子,參考方中達(dá)植病研究方法,采用噴霧接種方法進行反接種,并按照柯氏法則每處理取3個典型感病果,進行再分離。1.3菌落表面添加對子菌子的培養(yǎng)將病原菌株轉(zhuǎn)接于促孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)5~7d后,局部無菌刮除表層氣生菌絲,然后用滅菌的毛刷蘸無菌水涂刷在底層菌絲表面,置25~28℃,12h光照黑暗交替的環(huán)境中培養(yǎng),促使其產(chǎn)生孢子供分類鑒定和藥敏試驗。菌種鑒定參考真菌鑒定手冊。1.4給藥敏感測試1.4.1供試濃度培養(yǎng)基待篩選的藥物為70%甲基托布津(Thiophanate-Methyl)可濕性粉劑(日本曹達(dá)株式會社)、50%多菌靈(Carbendazim)可濕性粉劑(丙酮)(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司)、10%多抗霉素(Polyoxin)可濕性粉劑(陜西上格之路生物科學(xué)有限公司)、3%佳爽(Zhongshengmycin)可濕性粉劑(深圳市瑞德豐農(nóng)藥有限公司)、98%百菌清(Chlorothalonil)原藥(江蘇寶靈化工有限公司)、70%丙森鋅(Iprovalicarb)可濕性粉劑(拜耳作物科學(xué)公司)、50%異菌脲(Iprodione)可濕性粉劑(拜耳作物科學(xué)公司)、30%氟菌唑(Fujunzuo)可濕性粉劑(日本曹達(dá)株式會社)、77%可殺得(有效成分Cu(OH)2)可濕性粉劑(美國杜邦公司)、10%氟硅唑(Flusilazole)水乳劑(江蘇建農(nóng)農(nóng)藥化工有限公司)、20%異菌多菌靈懸浮劑(異菌脲:5%多菌靈:15%,浙江禾益農(nóng)化有限公司)。鑒于多數(shù)藥物溶解度很低,初試驗不配制高濃度母液,而直接稱取所需藥品加入冷卻的培養(yǎng)基中配制成供試濃度培養(yǎng)基;異菌脲和丙森鋅2種藥物不溶于水,稱好后先用丙酮震蕩懸浮才能較均勻的分散于培養(yǎng)基中。初試濃度梯度參考商家推薦稀釋倍數(shù)外延一定量來設(shè)計。1.4.2菌種懸浮液的制備病菌的預(yù)培養(yǎng):將病菌接種在馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)平板上,(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)。待菌落邊緣接近皿壁時,即可打取菌餅用于試驗。病菌孢子懸浮液的制備:將病菌在PSA平板上,(25±1)℃、12h/12h(D/L)黑暗光照條件下培養(yǎng)8d后,向培養(yǎng)皿中加入10mL無菌水,用無菌曲玻棒輕輕洗下菌落中的孢子,盡量減少菌絲斷裂。2層無菌紗布過濾得到分生孢子懸浮液,在顯微鏡下(10×10倍)檢查孢子數(shù),平均每視野60~100個孢子即可。1.4.3psa平板法測定細(xì)菌毒力參考嚴(yán)清平方法,采用平皿菌絲生長抑制法測定供試藥劑對病菌菌絲生長的抑制活性,即在初試驗的基礎(chǔ)上,選擇各藥劑對病菌菌絲生長抑制率在10%~90%范圍內(nèi)的5個濃度;將稱好的供試藥劑按照設(shè)定的濃度比例加入到冷卻至50℃左右的PSA培養(yǎng)基中,充分混勻后分別倒入3個滅菌的培養(yǎng)皿中,制成系列濃度的含藥PSA平板,以不加藥劑但含等量溶劑的PSA平板為對照。用直徑為6mm的打孔器在預(yù)培養(yǎng)的菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅,菌絲面朝下接種到含藥培養(yǎng)基平板中央,置于(25±1)℃下黑暗培養(yǎng),待對照的菌落邊緣接近皿壁時用十字交叉法測量各處理的菌落直徑,并求出3次重復(fù)的平均值,得出各處理的平均菌落增長直徑=(平均菌落直徑-6mm),并計算各藥劑處理對病菌的菌絲生長抑制率。抑制率=[對照的菌落增長直徑(mm)-處理的菌落增長直徑(mm)]/[對照的菌落增長直徑(mm)]×100%。以試驗中設(shè)定的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)(x),抑制率幾率值為縱坐標(biāo)(y),求出各藥劑對供試病菌的毒力回歸曲線方程y=a+bx、有效抑制濃度(EC50)。最后根據(jù)EC50值,分析比較不同殺菌劑對供試病菌菌絲生長的影響。1.4.4含藥瓊膠平板的制備對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用參考嚴(yán)清平方法,采用瓊膠平板測定法。將各藥劑分別加入到滅菌冷卻至50℃左右的水瓊膠培養(yǎng)基(瓊脂2%、蔗糖1%)中,制成濃度為1、10、100mg/L的含藥瓊膠平板,不加藥劑的瓊膠平板為對照。待瓊膠平板完全凝固后,以移液槍取200μL孢子懸浮液加入平板中,用曲玻棒涂抹均勻,置于(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)10~12h。待對照孢子萌發(fā)率超過90%以上時,在顯微鏡下(10×10倍)檢查各處理平板孢子萌發(fā)數(shù),每處理計數(shù)200個以上孢子。與空白對比,計算各藥劑對病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率,分析比較不同殺菌劑對供試病菌分生孢子萌發(fā)的影響。2結(jié)果與分析2.1型病斑,小斑,或期病斑,或規(guī)則病斑;該病原致病性很強,病害從春季開始顯癥,首先侵害幼葉。幼果長出后侵害幼果,此后可侵害各階段果子和葉子,并使之大量脫落形成空枝。病害侵害葉子,初為黃色沿葉脈擴散形成不規(guī)則病斑,后使局部甚至大半個葉子枯死;病菌侵害果子,病斑初為黃色或橙色、邊緣不整齊、形狀不規(guī)則的小病斑,后擴大成圓形,黑紅色病斑中間凹陷,大小為3~10mm,病斑周圍有黃色暈圈為菌絲擴散;病害不侵害果肉,但染過病的果子味苦難以食用。2.2分生孢子的培養(yǎng)從33個典型病果的病斑組織分離獲得的65個分離物,按照柯氏法則,果-歌1株為該病的病原菌。此菌株的分離頻率為98%。果-歌在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,新生菌絲白色,沿培養(yǎng)基向四周擴展很快,后期菌絲變成灰綠色、鼠灰色,菌絲體茂密。全黑暗培養(yǎng)條件下長期培養(yǎng)不產(chǎn)孢。黑暗培養(yǎng)1周后,刮除氣生菌絲并用毛刷刷無菌水于基內(nèi)菌絲表面,再進行光照黑暗交替培養(yǎng),即可產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子器球形,黑褐色或黑色,單質(zhì)或碳質(zhì),散生在培養(yǎng)基表層。分生孢子器近乎球形,有1孔口,壁革質(zhì)至炭質(zhì),黑色,直徑83.74~109.22μm,孔口直徑19.3~34.1μm。分生孢子長圓形,兩端各有油球1個,孢子大小為(5.3~8.2)μm×(1.6~2.3)μm。根據(jù)以上特征,該病原分類地位為半知菌亞門球殼孢目球殼孢科莖點屬Phomasp.,其種名有待進一步確定。2.31不同藥物對病原菌生長和子子合成的影響試驗結(jié)果表明,供試11種藥劑在商家推薦的稀釋倍數(shù)均能抑制菌絲生長,且多數(shù)藥劑經(jīng)多次稀釋后尚可完全抑制。藥物對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的毒力測定結(jié)果見表1。從表1可見,氟硅唑、中生菌素、多抗霉素、丙森鋅、氟菌唑、異菌脲6種藥物對病菌菌絲生長的抑制活性較高,其中氟硅唑的抑制效果最靈敏,其EC50為0.03μg/mL;丙森鋅和中生菌素次之,EC50分別為1.8μg/mL和3.14μg/mL;生產(chǎn)上常用的多菌靈及其同類藥物甲基托布津?qū)Υ瞬≡L的抑制作用較差,此2種藥物對孢子萌發(fā)的作用也甚微(表1)。對孢子萌發(fā)抑制效果好的藥物有氟硅唑、百菌清,1μg/mL抑制率在80%以上;中生菌素、多抗霉素和丙森鋅也有一定的保護作用。3田間病害防控利用分離的菌株進行噴霧接種,發(fā)病癥狀與典型癥狀比較結(jié)果證明,導(dǎo)致此柑橘褐斑病大規(guī)模流行的病原菌為莖點霉(Phomasp.)。莖點霉能侵染、危害多種農(nóng)作物、經(jīng)濟林樹,顯示弱致病性,而且多為與其它病原混合侵染;莖點霉引發(fā)嚴(yán)重柑橘病害為首次發(fā)現(xiàn)報道,并且可單獨侵染、顯示強致病性,導(dǎo)致生產(chǎn)