中藥治療腦出血后抑郁的機(jī)制研究

中藥治療腦出血后抑郁的機(jī)制研究

中風(fēng)后抑郁是指中風(fēng)后復(fù)發(fā)的抑郁。它的出現(xiàn)影響了中風(fēng)患者的神經(jīng)功能缺陷和認(rèn)知功能障礙，增加了中風(fēng)后的死亡率和自殺率，并長期影響了中風(fēng)患者的生活質(zhì)量。中藥頤腦解郁方治療腦卒中后抑郁癥臨床上取得較好療效。我們采用中藥頤腦解郁方干預(yù)腦出血后抑郁大鼠模型,以5-HT再攝取抑制劑百優(yōu)解做對照,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察大鼠腦內(nèi)不同部位5-羥色胺、去甲腎上腺素、酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,TH)陽性細(xì)胞表達(dá)的變化,以進(jìn)一步探討頤腦解郁方治療腦出血后抑郁的機(jī)理。1材料和方法1.1體重、體重健康Wistar雄性大鼠,二級,5~6月齡,32只,體重200g±10g。購于維通利華動物試驗(yàn)中心(合格證編號:SCXK(京)2004-0003)。1.2動物免疫組織化學(xué)試劑頤腦解郁方藥(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定),使用前按照灌胃劑量煎藥濃縮,濃度為0.62g生藥/ml,貯存于4℃冰箱中備用,臨用前加熱。百優(yōu)解(EliLillyandCompanyLimited,生產(chǎn)批號:A019602),按照成人用量(20mg/60kg·d)7倍計(jì)算大鼠用量(0.233mg/100g·d)。臨用時溶于蒸餾水中,混勻,濃度為0.233mg/ml。免疫組織化學(xué)試劑:北京中山生物技術(shù)有限公司兔抗5-羥色胺(5-HT),美國CHEMICON公司兔抗去甲腎上腺素(NE),美國SIGMA公司小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH)。武漢博士德生物工程有限公司二抗工作盒、DAB顯色試劑盒。1.3慢性應(yīng)激測試儀器自制大鼠夾尾瓶;游泳用水箱;HZQ-C空氣振蕩浴(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠);DF-206電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京京通儀器廠);自制大鼠黑白顛倒箱,以上用于慢性應(yīng)激的刺激。德國Leitz切片機(jī);美國Polyvar萬能顯微鏡;美國Media-cybernetics,Int產(chǎn)Image-ProPlus真彩病理圖像分析系統(tǒng)(version5.0.1.11)。1.4動物分組、給藥與術(shù)后管理用10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉后,局部消毒后,固定于SN2型腦立體定位儀上,顱骨鉆孔,按包新民等編繪的大鼠腦立體定位圖譜,定位尾殼核,以前囟為零點(diǎn),橫坐標(biāo)向左4mm,縱坐標(biāo)向后1mm,深度5mm,顱骨鉆孔,將微量注射器針頭垂直插入腦組織左側(cè)尾殼核內(nèi),用微量注射器緩注0.5μl膠原酶(sigma,Ⅶ型,0.5unit)到尾殼核內(nèi)。注射完畢留針3min~5min。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)1周后,予慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激21d,將動物予每周隨機(jī)進(jìn)行夾尾1min、禁水24h、禁食24h、45℃環(huán)境5min、明暗顛倒24h、水平振蕩30min(160次/min)、4℃冰水游泳5min方法刺激,每日采取一種方法進(jìn)行刺激。連續(xù)3周21d,每種刺激都進(jìn)行3次。1.5各組大鼠慢性應(yīng)激的比較首先用Open-field法做行為學(xué)評分,選擇得分相近的32只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥頤腦解郁方藥組(以下簡稱中藥組)和百憂解治療對照組(以下簡稱西藥組),每組8只。正常組每籠飼養(yǎng)4只,模型組、中藥組和西藥組每籠飼養(yǎng)1只。模型組、中藥組、西藥組均接受腦出血手術(shù)及21d慢性不可預(yù)見性應(yīng)激。慢性應(yīng)激刺激結(jié)束后,中藥組和西藥組分別接受灌胃給藥中藥頤腦解郁方、百憂解6周。模型組給予蒸餾水灌胃6周,正常組正常飲食飲水。1.6免疫組織化學(xué)法檢測腦心肌組織各組大鼠在完成實(shí)驗(yàn)過程后給予大鼠用10%的水合氯醛麻醉(用量為400mg/kg)腹腔注射麻醉,打開胸腔經(jīng)左心室插管到主動脈,剪開右心耳,先用預(yù)溫的37℃生理鹽水約200ml快速沖洗至流出液為淡紅色,再以預(yù)冷的10%甲醛灌注固定30min后,斷頭取腦,放入盛有相同灌注液的瓶中固定約2周后,常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋、切片,每張切片厚6um,進(jìn)行測定指標(biāo)的免疫組織化學(xué)法染色。1.7微波加熱修復(fù)抗原免疫組化染色用ABC法,步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟至水。(2)切片入3%H2O2水溶液室溫10min,蒸餾水洗滌3次。(3)切片入0.01M枸櫞酸緩沖液(pH6.0)微波加熱修復(fù)抗原。(4)滴加正常羊血清封閉,室溫30min。(5)兔抗5-羥色胺(5-HT,1∶50)、兔抗去甲腎上腺素(NE,1∶200)、小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH,1∶400),4℃過夜。(6)生物素化羊抗兔(小鼠)IgG,37℃1h。(7)滴加試劑SABC鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物,37℃1h。(8)使用DAB顯色試劑盒顯色,鏡下控制反應(yīng)時間。在步驟(3)、(5)~(7)后均用0.01MPBS漂洗3次,每次5min。陰性對照用正常羊血清代替一抗。1.8陽性細(xì)胞密度對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,每組選取3張切片,每張切片在同一部位選取3個視野,Image-ProPlus真彩病理圖像分析系統(tǒng)(version5.0.1.11)(Media-Cybernetics,Int),統(tǒng)計(jì)每個視野中陽性細(xì)胞平均光密度(density),平均陽性細(xì)胞面積(area)。1.9方差齊性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS6.12軟件進(jìn)行分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊直接進(jìn)行方差分析;方差不齊進(jìn)行參數(shù)替換后,進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊者進(jìn)行方差分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間差異采用方差分析(ANOVA/LSD),以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1大鼠海馬ca1-扣帶皮質(zhì)、5-ht陽性細(xì)胞表達(dá)變化正常組大鼠腦皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦內(nèi)均有5-HT陽性細(xì)胞。5-HT陽性神經(jīng)元胞體大,5-HT表達(dá)在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),胞漿呈棕黃色,有粗大顆粒,有些神經(jīng)細(xì)胞核區(qū)有表達(dá)。模型組大鼠腦海馬CA1、扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)減少,圓形空泡樣,分布稀疏,顏色淺淡,面積下降,光密度下降,與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P<0.05)。西藥組海馬CA1、扣帶皮質(zhì)表達(dá)面積增多,顏色變深,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05)。中藥治療組5-HT陽性細(xì)胞在海馬CA3、梨狀皮質(zhì)表達(dá)增多,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05,見表1)。2.2對腦膠質(zhì)瘤大鼠臟器th陽性細(xì)胞表達(dá)的影響TH陽性細(xì)胞主要表達(dá)在未定帶和下丘腦,酪氨酸羥化酶表達(dá)在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,胞漿表達(dá),也存在深棕色的纖維樣表達(dá)。模型組下丘腦TH陽性細(xì)胞表達(dá)減少,顏色變淺,陽性細(xì)胞面積、光密度下降與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異(P<0.05)。西藥組可增加下丘腦TH陽性細(xì)胞的表達(dá)面積,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。中藥組可增加下丘腦TH陽性細(xì)胞的表達(dá)面積和表達(dá)顏色,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05,見表2)。2.3各組大鼠扣帶皮質(zhì)和臟器組織形態(tài)變化的比較正常組大鼠腦皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)有NE陽性細(xì)胞表達(dá),在腦皮質(zhì)內(nèi)可見I~VI層均有NE陽性細(xì)胞,但主要集中在Ⅱ~Ⅳ。去甲腎上腺素表達(dá)在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,核區(qū)也有表達(dá),同時血管壁也有表達(dá)。模型組大鼠扣帶皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)NE陽性細(xì)胞顏色變淺,呈空泡樣,平均陽性細(xì)胞光密度下降,較正常組明顯減弱(P<0.05)。西藥組在扣帶皮質(zhì)和下丘腦表達(dá)面積增多,顏色加深。中藥組在扣帶皮質(zhì)、下丘腦內(nèi)NE陽性細(xì)胞表達(dá)面積增多,顏色加深,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.05,見表2)。3不同腦損傷對psd的影響腦出血后抑郁癥是一種器質(zhì)性情感障礙,其通常緩慢起病,病程遷延。腦內(nèi)單能神經(jīng)功能低下是構(gòu)成腦出血后抑郁的病理生理基礎(chǔ)。目前研究表明,腦內(nèi)5-HT、NE含量下降,神經(jīng)傳導(dǎo)通路受損可引起腦卒中后抑郁的發(fā)生,與腦卒中后抑郁癥產(chǎn)生相關(guān)的腦定位損害主要的是額葉/顳葉-基底節(jié)-腦干腹側(cè)這一環(huán)路。Vataja等通過對109例PSD患者顱腦MRI研究表明,左額葉皮層下環(huán)路、尾狀核、丘腦、內(nèi)囊膝部的病變與PSD的發(fā)生密切相關(guān)。近來,越來越多的學(xué)者認(rèn)為額葉基底部的病變與PSD的關(guān)系更為密切。大腦損傷的不對稱性對PSD的發(fā)生有影響,左側(cè)大腦半球損傷與抑郁有關(guān),其中左側(cè)額葉和左側(cè)基底節(jié)損傷病人的PSD發(fā)生率更高,Mayberg等應(yīng)用正電子發(fā)射斷層檢測急性腦卒中后抑郁患者時發(fā)現(xiàn),患者中樞內(nèi)5-HT和NE遞質(zhì)水平低下。呂路線研究顯示,腦脊液單胺類遞質(zhì)水平與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)。鐘明奎研究在大鼠基底外側(cè)杏仁核中增加5-HT可使大鼠開野實(shí)驗(yàn)自主活動增加,改善抑郁狀態(tài)。TH是兒茶酚胺(多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素)合成的限速酶。酪氨酸羥化酶表達(dá)下降則可直接引起兒茶酚胺合成下降。兒茶酚胺合成的短周期調(diào)節(jié)是TH酶活性的調(diào)節(jié)。長周期調(diào)節(jié)是TH酶蛋白量的調(diào)節(jié),是通過TH酶蛋白數(shù)量增加,是在神經(jīng)元胞體水平進(jìn)行,作用發(fā)生慢而持久。頤腦解郁方,臨床上起到了改善患者抑郁證候的效果。本研究顯示,腦出血后抑郁模型腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、扣帶皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞表達(dá)減少,下丘腦TH陽性細(xì)胞表達(dá)減少,扣帶皮質(zhì)和下丘腦內(nèi)NE表達(dá)減少。