同型半胱氨酸檢測原理及方法

上海市臨床檢驗中心1.同型半胱氨酸〔Hcy),是一種與半胱氨酸同系的、含硫含氨酸分解代謝的重要中間產(chǎn)物，不參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成。血漿Hcy是一個總稱,指血漿中所有形式的Hcy,包括復原型Hcy,雙硫Hcy,混合雙硫半胱氨酸‐Hcy和混合雙硫蛋白質(zhì)‐Hcy

：正常情況下游離

Hcy很少

，主要以蛋白質(zhì)形式存在，與血漿蛋白結(jié)合后，會形成以雙硫鍵與白蛋白結(jié)合的蛋白Hcy。很多因素如遺傳、營養(yǎng)、腎功能不全、藥物、激素等因素均可能影響體內(nèi)同型半胱氨酸的代謝

，造成高Hcy血癥。2.同型半胱氨酸巰基內(nèi)酯，與低密度脂蛋白形成復合體，隨后被巨噬細胞吞噬，形成泡沫細胞。促進血凝塊的形成，從而引起臨床上常見的堵塞性疾病。所以高Hcy是動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的獨立危險因子；Hcy和高血壓之間有一定的相關性，有效控制Hcy水平對高血壓病例意義重大。CBSHomocysteinemetabolisminmanand

animals.Homocysteinemetabolism.Homocysteinemetabolismincludesthemethionine

cycle,remethylationandtranssulfurationpathways,andthefolatepathway.AdoMet,S-adenosylmethionine;R,methylgroupacceptor;AdoHcy,S-adenosylhomocysteine;CBS,cystathionineβ-synthase;CL,cystathionineγ-lyase;MS,methioninesynthase;THF,tetrahydrofolate;MTHFR,methylenetetrahydrofolatereductase;B6,vitaminB6;B12,vitaminB12;B2,vitaminB2(Nygardetal.,1999;usedwith

permission).3.葉酸、維生素B12和B6為同型半胱氨酸代謝所必需，它們的缺乏會導致同型半胱氨酸濃度的升高。目前研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后期孕婦的同型半胱氨酸的值要高于非孕期的值，妊娠期高同型半胱氨酸及葉酸、維生素B12缺乏可能是先兆子癇和未來心血管疾病風險的危險因素，先兆子癇患者高水平的同型半胱氨酸會從妊娠早期一直持續(xù)到分娩。目前也有研究顯示，與正常葡萄糖耐受水平的女性相比，妊娠糖尿病女性的同型半胱氨酸水平顯著升高，并在妊娠中期持續(xù)增加。Effectsoffolate,vitaminB12-,andvitamin

B6-deficienciesonfastingplasmahomocysteine

levels.4.以高同型半胱氨酸血〔尿〕癥為特征的代謝遺傳性疾病，如胱硫醚‐β‐合成酶〔CBS〕、亞甲基四氫葉酸復原酶〔MTHFR〕等代謝酶的基因缺陷導致的代謝酶的缺乏。MTHFRC677T和CBS844ins68的多態(tài)性研究。小結(jié)：導致高同型半胱氨酸血〔尿〕癥先天遺傳性疾病，CBS、MTHFR等代謝酶的基因缺陷導致；后天獲得性：營養(yǎng)性，包括代謝過程中各類氨基酸的缺乏導致；其他疾病，如腎功能不全導致分泌排泄異常，其他疾病用藥干擾B族維生素的代謝而導致。1.在室溫下，同型半胱氨酸會從紅細胞中釋放出，全血儲存不當時，會導致同型半胱氨酸測定的錯誤。因此血液采集后應立即放在冰上或冷藏，血漿應在30分鐘內(nèi)別離和冷凍〔冷藏〕。血漿一旦進行別離，同型半胱氨酸就極為穩(wěn)定，能夠經(jīng)受屢次反復凍融，測量濃度幾乎沒有變化。2.Hcy非?；顫?，因為它含有巰基〔硫醇〕組，很容易氧化，形成各種硫化物。血漿中游離HCY的比例，僅為血漿總Hcy〔tHcy〕的2%。3.同型半胱氨酸〔Hcy〕致血管病變機制致血管內(nèi)皮細胞損傷和功能異常對血管平滑肌細胞(VSMCS)的影響刺激血管平滑肌增殖對凝血系統(tǒng)的影響增加血液中血小板的黏附性對血脂的影響三、常用Hcy測定方法色譜法：HPLC、GC-MS/MS具有很高的準確度和穩(wěn)定性，缺點是處理標本的能力有限，臨床實驗室未配備設備及操作人員，常作為同型半胱氨酸檢測的參考方法熒光偏振免疫檢測（FPLA）成本高，需專用儀器。酶聯(lián)免疫靈敏度高特異性強，但精密度差，耗費人力，操作時間長，不適宜做單個標本和急診標本?；瘜W發(fā)光成本高，需專用儀器循環(huán)酶法：水解循環(huán)酶法、胱硫醚循環(huán)酶法可在大型生化分析儀上使用，操作簡單，結(jié)果準確可靠，且可和其他參數(shù)進行同時分析，目前最為常用的臨床檢測方法；常用方法優(yōu)缺點；1984年，Demaster等人第一次報道了高效液相色譜法檢測血漿中的總同型半胱氨酸；HPLC-FD檢測原理：血漿中Hcy、混合型硫化物及蛋白質(zhì)結(jié)合的Hcy經(jīng)巰基復原劑處理之后，再與巰基結(jié)合的熒光物質(zhì)質(zhì)SBD‐F充分反響形成帶有共軛結(jié)構(gòu)的化合物，其受紫外光激發(fā)后，能輻射出熒光，而且在一定條件下，熒光強度和樣品的濃度呈正比。改進HPLC:血漿樣品經(jīng)預處理，復原和脫蛋白后，衍生化進行酸化處理，2-巰基乙胺作為內(nèi)標。通過使用一個inertisilODS-3柱用醋酸鈉緩沖液為流動相進行別離。高效液相電化學法〔HPLC‐ED〕2.LC-MS/MS,基于同型半胱氨酸-d8〔2nmol/L〕作為內(nèi)部標準添加于100mL血漿或尿液中，樣品復原和脫蛋白后，進行分析，在多反響監(jiān)測模式，通過將前體轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物離子對tHcy和hcy-d4進行檢測〔分別m/z136，m/z90和m/z140，m/z94，〕。tHcy與hcy-d4保存時間分別是1.5min和2.5分鐘?！睲ethodfortheDeterminationofTotalHomocysteineinPlasmaandUrinebyStableIsotopeDilutionandElectrosprayTandemMassSpectrometry，ClinicalChemistry45:91517–1522(1999)〕3.熒光偏振免疫分析法〔FPLA),1995年由雅培公司研制出，并用雅培專用儀器AbbottIMx自動免疫分析儀進行檢測。 檢測原理：同型半胱氨酸在S一腺苷同型半胱氨酸水解酶的作用下生成S一腺苷同型半胱氨酸〔SAH);鼠抗人抗SAH單克隆抗體及SAH熒光標記物組成FPLA的檢測系統(tǒng)；計算mP單位的熒光偏振光。FPLA法與HPLC法有良好相關性，其結(jié)果準確有可靠，自動化程度高，檢測速度快;其以高選擇性的酶為底物，可以防止與同型半胱氨酸相似的氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸的干擾，提高檢測特異性，具有較高的靈敏度和精密度。但需要專用儀器。4.ELISA法：是一種無需預處理的方法，根本原理為：〔１〕二硫蘇糖醇〔DTT〕復原，S‐腺苷同型半胱氨酸水解酶催化Hcy和腺苷反響生成S‐腺苷同型半胱氨酸；〔２〕參加S‐腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑終止反應后，用腺苷酸降解剩余腺苷除去干擾；〔３〕由抗S‐腺苷同型半胱氨酸單克隆抗體組成的競爭性酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)定量測定S‐腺苷同型半胱氨酸〔SAH〕。用該法測定Hcy，線性與實驗性良好，受膽紅素、溶血、脂血的干擾較小，并且該法與HPLC法有良好的相關性。非自動化，但簡單本錢低，適宜基層單位開展使用。

HPLC法或LC-MS/MS法，均檢測時間長，儀器昂貴，對技術人員要求高，因此不是常規(guī)臨床化學實驗室的選擇。1. 目前可在大型生化分析儀上使用的方法為循環(huán)酶法，循環(huán)酶法又分為直接法和間接法，直接法又名水解酶循環(huán)酶法，因其特異性高、抗干擾力強，故目前循環(huán)酶法檢測試劑以水解循環(huán)酶法為主。水解循環(huán)酶法主要原理是S一腺苷同型半胱氨酸水解酶在三(2-羧乙基)膦(TCEP)作用下，氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為游離型Hcy，游離型Hcy與共價底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶〔HMTase〕催化反響形成甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被SAH水解酶(SAHase)水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循環(huán)參加反響，從而放大檢測信號，生成物腺苷(Ado)立即水解為次黃嘌呤和氨，氨在谷氨酸脫氫酶(GLDH)的作用下，使復原型輔酶I(NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型輔酶I(NAD+)，Hcy濃度與NADH變化呈正比。〔2009年〕 水解循環(huán)酶法反響式：TCEP氧化型Hcy———→游離型HcyHMTase游離型Hcy＋SAM———→SAH＋甲硫氨酸SAHaseSAH———→腺苷＋HcyADA腺苷＋H2O———→次黃嘌呤＋NH4+GLDHNH4+＋NADH＋α-酮戊二酸———→谷氨酸＋NAD+＋H2O2.間接循環(huán)酶法又名胱硫醚循環(huán)酶法，其原理是結(jié)合的Hcy被復原成游離的Hcy，在胱硫醚‐β‐合成酶〔CBS〕的催化下和絲氨酸反響生成L‐胱硫醚，L‐胱硫醚被胱硫醚‐β‐裂解酶(CBL)分解成Hcy和丙酮酸，丙酮酸參與NADH的顯色反響，生成的Hcy再次參與第一步反響，如此循環(huán)?！?004年〕 胱硫醚循環(huán)酶法反響式:CBS絲氨酸+Hcy———→L-胱硫醚CBLL-胱硫醚———→Hcy＋丙酮酸＋NH3LDH丙酮酸＋NADH＋H+———→乳酸＋NAD+循環(huán)酶法測定Hcy原理直接法〔水解酶法〕同型半胱氨酸在體內(nèi)的主要代謝途徑：間接法〔胱硫醚法〕3.胱硫醚法與水解酶法的比較胱硫醚法以美國CATCH公司為代表，水解酶法以DiazymeLaboratories為代表；胱硫醚法測量Hcy轉(zhuǎn)化為β-胱硫醚時產(chǎn)生的胱硫醚，不能消除內(nèi)生β-胱硫醚，所以胱硫醚法的Hcy試劑受到內(nèi)生胱硫醚的明顯干擾，如某些內(nèi)生β-胱硫醚水平高的腎臟疾病患者〔高達>300μmol/L〕。水解酶法會受到S-腺苷高半胱氨酸〔SAH〕的嚴重干擾。水解酶法試劑中含有的酶〔5個或4個〕多于胱硫醚法的，故水解酶法的特異性與抗干擾能力高于胱硫醚法。使用胱硫醚法試劑檢測時，會受到鐵試劑的干擾，常規(guī)的沖洗程序并不能有效地解決此問題，故檢測時應將同型半胱氨酸與鐵工程分開檢測?！?005年，美國FDA曾就此問題向CATCH公司發(fā)出過警告信〕4.胱硫醚法與HPLC及免疫化學法比較：與之前廣泛使用的HPLC法的不精密度相比，酶法更為精密，但稍低于FPLA法。血漿tHcy濃度測定與高效液相色譜法和免疫化學測定相比，雖然有著很好的線性關系，但還是存在著微小但較顯著的差異?！睲ulticenterAnalyticalEvaluationofanEnzymaticMethodfortheMeasurementofPlasmaHomocysteineandComparisonwithHPLCandImmunochemistry,ClinicalChemistry50,No.5,2004〕1.2017年第一次室間數(shù)據(jù)顯示，上海地區(qū)200多家檢測同型半胱氨酸的臨床實驗室，使用同型半胱氨酸檢測試劑品牌多達30多種；2.檢測方法90%為循環(huán)酶法。樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5檢測方法寧波美康（n=27）均值(umol/L)13.226.720.133.16.3水解酶法CV5.9%7.9%6.4%8.9%9.6%邁克（n=16）均值(umol/L)12.325.218.831.75.7CV5.3%6.0%4.9%6.1%4.6%羅氏（n=5）均值(umol/L)12.227.019.734.15.6CV16.0%13.5%14.2%12.5%25.6%英國Axis-Shield（n=12）均值(umol/L)12.828.920.536.35.7胱硫醚法CV10.7%5.3%8.0%4.9%8.6%3.結(jié)論寧波美康的低值樣品均值要高于其他試劑品牌；羅氏試劑的室間質(zhì)控品各實驗室檢測結(jié)果變異較大；水解酶法和胱硫醚法的室間檢測結(jié)果無明顯差異。1.目前試劑廠家有溯源的校準品一般溯源至美國NIST