cdh1基因種系突變與家族性胃癌乳腺癌綜合征的關(guān)系

cdh1基因種系突變與家族性胃癌乳腺癌綜合征的關(guān)系

根據(jù)臨床研究，一些腫瘤有家族病史。換句話說，同一家腫瘤發(fā)病率很高，發(fā)病年齡很小。腫瘤的發(fā)生部位可以不局限于同一組織或器官。此種家族發(fā)病有呈常染色體顯性遺傳特點(diǎn),以往稱之為“癌家族”,最近文獻(xiàn)將其稱為遺傳性癌癥綜合征。該家族中若包括先證者在內(nèi)的一、二級親屬中有3人以上發(fā)生同一種癌腫,便可認(rèn)為此癌腫極有可能與遺傳基因有關(guān)。迄今已經(jīng)確認(rèn)的遺傳性癌癥綜合征超過20余種,外科領(lǐng)域中多見的有遺傳性非息肉病性大腸癌,遺傳性甲狀腺髓樣癌,遺傳性乳腺癌/卵巢癌綜合征和遺傳性胃癌/乳腺癌綜合征。最近,國際胃癌合作組織的報道顯示,遺傳性彌漫型胃癌家系成員CDH1突變基因攜帶者不但胃癌發(fā)病危險性增加,乳腺癌、結(jié)直腸癌發(fā)病危險性也增加。本實(shí)驗(yàn)室2年來收集到1個獨(dú)特的中國人家族性癌癥綜合征家系,先證者2年內(nèi)先后發(fā)生彌漫型胃癌及乳腺癌,其一、二級親屬中有5人患乳腺及結(jié)直腸癌等腫瘤,包括先證者在內(nèi)的3人為乳腺癌。遂對該家系成員進(jìn)行了CDH1基因種系突變分析及先證者胃癌/乳腺癌組織的病理學(xué)及CDH1基因編碼蛋白E-cadherin表達(dá)研究。材料和方法1.左乳腺癌保乳手術(shù)先證者,女,首發(fā)胃癌時41歲,父母為近親結(jié)婚。先證者于2001年11月在本科接受胃癌根治術(shù),病理學(xué)檢查證實(shí)為彌漫型印戒細(xì)胞癌。2003年6月因左乳外上象限腫瘤在本科接受左乳腺癌改良根治術(shù),病理檢查證實(shí)為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。先證者的一級、二級親屬中先后5人有乳腺癌、結(jié)直腸癌或兩肺轉(zhuǎn)移性癌家族史,另外1名姐妹因乳腺增生癥而定期隨訪觀察。收集該家系成員11人外周血備CDH1基因突變分析。2.cdh1基因多態(tài)性檢測收集目前可獲得的家系成員外周血各5ml,枸櫞酸鈉抗凝、混勻。淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞,標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿法抽提DNA。以樣本DNA為模板,分別加入CDH1基因第1~16外顯子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(各外顯子引物序列及反應(yīng)條件見表1)。對擴(kuò)增產(chǎn)物行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。篩選出有電泳條帶異常的外顯子,對其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行基因序列測定。3.免疫組化染色手術(shù)切除的胃癌/乳腺癌標(biāo)本用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片3μm。其中1張行H-E染色,觀察組織病理形態(tài),另2張進(jìn)行E-cadherin和β-catenin單克隆抗體免疫組化染色。E-cadherin與β-catenin單克隆抗體以及EnVision兩步法免疫組化試劑購自Dako公司。CDH1基因1~16外顯子引物及反應(yīng)條件見表1。4.pcr檢測方法先證者病理組織標(biāo)本采用英國Shandon公司全自動組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)處理,石蠟切片機(jī)切片。日本OlympusBX51診斷顯微鏡觀察,攝像。PTC-200PCR擴(kuò)增儀為美國MJResearch產(chǎn)品。電泳凝膠成像系統(tǒng)為美國BIO-RAD產(chǎn)品。DNA測序儀為美國ABI產(chǎn)品。結(jié)果1.外顯子檢測異常圖1為該多發(fā)性癌癥綜合征家系圖譜。通過PCR-SSCP法篩選,除第13外顯子外,其余外顯子均未檢測到異常。外顯子13的電泳結(jié)果顯示,包括先證者在內(nèi),該家系中有3人電泳條帶異常,見圖2,其中1人為先證者兄長,40歲時已接受直腸癌切除術(shù),另1人為先證者外甥女,29歲,未發(fā)病。2.pcr-sscp分析對家系所有成員的外周血DNA應(yīng)用第13外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測定。測序結(jié)果顯示,在PCR-SSCP分析中有電泳條帶異常者,其第13外顯子mRNA水平2200位點(diǎn)(序號:NM-004360)存在C→T單個核苷酸置換,使編碼序列由GCC→GCT,突變前后兩序列均編碼丙氨酸(Ala154Ala),見圖3。3.蛋白-catenin表達(dá)先證者胃癌為8cm×8cm,浸潤潰瘍型。顯微鏡下,瘤細(xì)胞散在排列,彌漫浸潤于胃壁內(nèi),不形成腺體,浸潤達(dá)深肌層;單個細(xì)胞內(nèi)可見黏液潴留,呈典型的印戒細(xì)胞癌組織像,見圖4。CDH1編碼蛋白E-cadherin單克隆抗體免疫組化染色顯示,大部分瘤細(xì)胞尚保留E-cadherin表達(dá),部分區(qū)域E-cadherin表達(dá)較周圍正常胃黏膜有所下降,見圖4。與E-cadherin共同發(fā)揮細(xì)胞粘附功能的蛋白β-catenin單克隆抗體免疫組化染色證實(shí),大部分癌組織也保留β-catenin陽性染色。先證者左乳腺腫瘤為2cm×1cm。顯微鏡下見瘤細(xì)胞呈片狀、巢狀排列,部分癌巢中央可見壞死。癌巢與癌巢間為纖維組織間質(zhì),腫瘤細(xì)胞異形性明顯,核分裂像易見,呈典型的浸潤性導(dǎo)管癌組織像,見圖5。E-cadherin單克隆抗體免疫組化染色顯示,與周圍殘存的良性導(dǎo)管上皮相比,瘤細(xì)胞E-cadherin及β-catenin蛋白表達(dá)均有所下降,見圖5。cdh1基因家系分析及病理研究多年臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),有些家族存在胃癌及乳腺癌聚集現(xiàn)象,先證者可同時或異時患胃癌及乳腺癌,且此種家族中患病者發(fā)病年齡均較輕,以40歲前后發(fā)病居多,一般首發(fā)年齡不超過50歲。隨著分子生物學(xué)技術(shù)向臨床研究的深入,對同一家族中兩代人內(nèi)有3人以上發(fā)生同一癌腫家系的分析發(fā)現(xiàn),該種家系內(nèi)往往存在某種基因的種系突變。如以彌漫型胃癌家系為例,自1998年Guilford等首次報道新西蘭毛利人胃癌家系中存在CDH1基因種系突變以來,CDH1基因的種系突變與年輕發(fā)病的彌漫型胃癌的關(guān)系已引起廣大腫瘤研究者的關(guān)注。此后又有研究顯示,CDH1基因種系突變攜帶者的彌漫型胃癌和乳腺小葉癌發(fā)病率均增加,認(rèn)為CDH1基因是與彌漫型胃癌及乳腺小葉癌關(guān)系密切的基因。但晚近研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌高發(fā)家系中,乳腺癌的組織學(xué)類型與基因突變關(guān)系并不密切,無論是乳腺導(dǎo)管癌還是小葉癌均可發(fā)生CDH1基因突變。迄今尚未見有關(guān)中國人胃癌/乳腺癌先證者的家族性癌癥綜合征家系CDH1基因種系突變分析及臨床病理特征的報道。本實(shí)驗(yàn)室收集的家系內(nèi)先證者為異時性發(fā)生、年輕發(fā)病(首發(fā)胃癌時為41歲)的彌漫型胃癌/乳腺癌患者,因家系一級、二級親屬中5人有年輕發(fā)病的癌腫病史,其中結(jié)直腸癌1人,死于轉(zhuǎn)移性肺癌2人,乳腺癌3人,所有發(fā)病者發(fā)病時年齡均未超過50歲,遂將該家系納入基因突變分析研究。首先,我們選擇了在遺傳性彌漫型胃癌/遺傳性乳腺癌家系報道較多的CDH1基因進(jìn)行外周血CDH1種系突變分析。已知CDH1基因位于第16號染色體長臂,是具有16個外顯子的抑癌基因,編碼120×103的E-cadherin糖蛋白,表達(dá)于上皮細(xì)胞膜。E-cadherin的主要功能是通過與胞質(zhì)內(nèi)β-catenin結(jié)合,介導(dǎo)同種上皮細(xì)胞之間的連接,維持上皮細(xì)胞極性。E-cadherin蛋白變異將導(dǎo)致上皮細(xì)胞間的連接喪失,使細(xì)胞遷移性增加。對該家系成員CDH1基因突變分析表明,盡管包括先證者在內(nèi)3人存在CDH1第13外顯子mRNA水平2200位點(diǎn)C→T單個核苷酸置換,但未造成編碼氨基酸改變,在遺傳學(xué)上稱為同義突變(即沉默性突變)或?qū)儆趩魏塑账岫鄳B(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。對先證者胃癌及乳腺癌組織的CDH1編碼蛋白E-cadherin表達(dá)研究顯示,盡管部分腫瘤細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)減弱,但大部分瘤細(xì)胞尚可見E-cadherin蛋白表達(dá),與CDH1基因分析結(jié)果吻合,可以認(rèn)為該家系中檢測到的單個核苷酸置換未引起編碼蛋白變異。至于部分腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)減弱可能與腫瘤細(xì)胞較正常上皮細(xì)胞分化程度偏低有關(guān)。對先證者胃癌以及乳腺癌標(biāo)本的組織病理學(xué)研究顯示,異時性發(fā)病的胃癌為典型的印戒細(xì)胞型彌漫型胃癌,而左乳腺腫瘤為典型的浸潤性導(dǎo)管癌,兩種癌腫之間并無形態(tài)學(xué)