一氧化氮的研究進(jìn)展

一氧化氮的研究進(jìn)展

20世紀(jì)80年代，flav發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和血管內(nèi)側(cè)擴(kuò)張因子（edf）。1987年，palm等人通過了edf的化學(xué)性質(zhì)。大量研究表明,NO在心血管、免疫、神經(jīng)、消化等系統(tǒng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。一氧化氮合酶(NOS)是NO合成的催化酶,由于NO具有廣泛而重要的生理和病理學(xué)功能,使得NO,NOS的研究已經(jīng)成為現(xiàn)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。1號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生的nosNO是一種氣體自由基,分子中有一未配對(duì)電子,可形成自由基,和其它分子如氧分子、超氧自由基,或過渡金屬(如與haemoproteins血紅蛋白結(jié)合的鐵)反應(yīng)。在體內(nèi)極不穩(wěn)定,是一短壽分子,半衰期僅為3~5s。NO具有脂溶性,可以快速透過生物膜擴(kuò)散,在體內(nèi)迅速被血紅蛋白、氧自由基或氫醌等滅活。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成。不同類型的細(xì)胞中,存在不同類型的NOS,通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生NO。NOS是NO合成過程中的關(guān)鍵酶,由于NO性質(zhì)活潑,半衰期短,因此許多關(guān)于NO的研究都集中在NOS的研究上。現(xiàn)已知NOS有3種類型,可以廣義的將其分為兩種,即構(gòu)成型一氧化氮合酶(cNOS)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)型(iNOS或NOS2)。cNOS包括內(nèi)皮組織(eNOS或NOS3)和神經(jīng)系統(tǒng)(nNOS或NOS1)。它們?cè)诮M織分布、調(diào)節(jié)方式、生物活性和NO產(chǎn)生量方面都有區(qū)別。cNOS主要分布在內(nèi)皮組織(eNOS)和神經(jīng)系統(tǒng)(nNOS),主要負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO的合成,調(diào)節(jié)各種生理功能。它們依賴Ca2+的存在,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)被激活。cNOS合成小量的、短期的NO,引起NO濃度的快速增加,而當(dāng)Ca2+濃度減小時(shí),NO量迅速下降,形成一個(gè)博動(dòng)性的NO釋放,這是生理調(diào)節(jié)所必須的NO。eNOS是膜結(jié)合型的,在血管緊張度控制和血小板凝集中有一定的作用,nNOS是細(xì)胞溶質(zhì)的,發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)作用,在人的骨骼肌里已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它的mRNA。iNOS在多種細(xì)胞中均有表達(dá),iNOS不僅在免疫反應(yīng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中表達(dá),而且在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞,包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞,以及非哺乳動(dòng)物,包括昆蟲和植物中均有表達(dá)。iNOS是非Ca2+依賴型,其激活不需要Ca2+濃度升高。iNOS在靜息細(xì)胞內(nèi)是不表達(dá)的,當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子或免疫微生物刺激,如革蘭氏陰性桿菌的脂多糖LPS強(qiáng)烈誘導(dǎo),iNOS催化合成非生理濃度的大量NO,產(chǎn)生一系列病理作用。2nos釋放量與機(jī)體生理機(jī)能NO是一個(gè)普遍存在的影響多種生理病理過程的信號(hào)分子,其存在于多種細(xì)胞中,如巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。NO主要具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、血壓生理調(diào)控和抑制血小板凝聚等生理功能。在許多組織中,盡管其真正的釋放量目前尚難于檢測(cè),但已確知會(huì)釋放出不同濃度的NO,且濃度的變化與機(jī)體生理機(jī)能緊密相關(guān)。免疫功能、血流量、血小板凝集反應(yīng)、神經(jīng)傳遞和記憶等內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定作用都普遍伴隨有低水平的NO。而過多的NO通常伴隨有炎癥和免疫紊亂、疼痛、神經(jīng)疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等。不同類型NOS催化合成的NO也會(huì)產(chǎn)生不同的生理病理作用,構(gòu)成型NOS產(chǎn)生小量的NO(皮摩爾級(jí)),參與信號(hào)傳遞,產(chǎn)生生理效應(yīng),而細(xì)胞因子或內(nèi)毒素刺激細(xì)胞釋放的大量的NO(納摩爾級(jí)),是由誘導(dǎo)亞型的NOS合成的,介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒和細(xì)胞生長抑制。盡管NO維持黏膜的血管舒張和血管通透性,但是過多的NO也可直接引起細(xì)胞毒性作用,與過氧化物一起導(dǎo)致過氧化,從而引起組織損傷。3nos的生物活性NO在體內(nèi)主要參與以下3個(gè)反應(yīng):①激活鳥苷酸環(huán)化酶,發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)功能。NO-cGMP信號(hào)通路廣泛存在于人類和動(dòng)物的多種組織和細(xì)胞中,它代表一種新的細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。NO可激活sGC,使細(xì)胞內(nèi)cGMP增加,啟動(dòng)一系列蛋白磷酸化反應(yīng),從而發(fā)揮不同的生理功能。②與紅細(xì)胞中的血紅蛋白結(jié)合生成亞硝酸血紅蛋白而失去活性。擴(kuò)散對(duì)于NO的局部調(diào)節(jié)作用非常重要,而且是其生物半衰期的決定因素,NO極易與血管腔中紅細(xì)胞的氧合血紅蛋白結(jié)合而被滅活,使其在血管腔中形成一個(gè)極陡的擴(kuò)散梯度,發(fā)揮局部調(diào)節(jié)作用。③與超氧陰離子反應(yīng),產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的過氧化亞硝酸。NO極易與O-2反應(yīng)不可逆地生成ONOO-,病理?xiàng)l件下NO是體內(nèi)產(chǎn)生的唯一能與SOD競爭O-2的生物分子,當(dāng)細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生大量的NO和O-2時(shí),生成有毒的強(qiáng)氧化劑——ONOO-,ONOO-是NO的主要毒性作用形式。三種亞型的NOS都是二聚體型的,一個(gè)硫醇鹽協(xié)調(diào)的亞鐵血紅素環(huán),一個(gè)四氫生物喋呤(H4B)輔助因子和一個(gè)L-精氨酸(L-Arg)/N-羥精氨酸底物結(jié)合部位組成NOS的催化中心。NOS二聚體的每一個(gè)亞基均包含兩個(gè)區(qū)域:一個(gè)結(jié)合FMN,FAD和NADPH的還原區(qū)和一個(gè)含有亞鐵血紅素和四氫生物喋呤的氧化區(qū)。電子從還原區(qū)轉(zhuǎn)移到氧化區(qū)是酶活性所必需的,由鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)。當(dāng)鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物存在時(shí),電子從一個(gè)亞基的NADPH通過FMN和FAD傳遞到另一個(gè)亞基的氧化區(qū)。4inos基因表達(dá)調(diào)節(jié)NO調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜而緊密的過程。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子或免疫微生物刺激時(shí),iNOS催化產(chǎn)生大量NO,細(xì)胞內(nèi)NO含量的變化受底物利用度、iNOS蛋白酶活性、表達(dá)水平和或其它構(gòu)成亞型NOS酶活性影響。最近的研究顯示,NO通過調(diào)節(jié)NF-кB水平產(chǎn)生一個(gè)自動(dòng)調(diào)整作用。在低濃度NO時(shí),NF-кB水平上升,上調(diào)iNOS表達(dá),相反,在高濃度NO時(shí),NF-кB水平和DNA結(jié)合活性被抑制,減少iNOS轉(zhuǎn)錄。顯示了NO濃度依賴雙重性,及自身表達(dá)NO的緊密的自身調(diào)節(jié)。iNOS的調(diào)節(jié)主要是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平,調(diào)節(jié)iNOS表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括:NF-κB、激活蛋白1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活子1α、干擾素調(diào)節(jié)蛋白1、核因子白介素-6和高活力簇1(Y)蛋白等。不同的上游信號(hào)途徑增強(qiáng)或抑制iNOS表達(dá),還依賴于刺激和細(xì)胞的類型。NF-кB/Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子是iNOS基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器,也是免疫和炎癥的主要調(diào)節(jié)因子。在包括缺失分析和結(jié)合序列的選擇性堿基突變的研究顯示在大鼠iNOS啟動(dòng)子的-85至-76和-971至-962有兩個(gè)κB位點(diǎn),對(duì)于iNOS基因的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力是關(guān)鍵的,LPS完全誘導(dǎo)的iNOS基因表達(dá),這些кB位點(diǎn)必須與蛋白結(jié)合。在-942至-934(13)和-879至-871(10)存在兩個(gè)IFN-γ激活位點(diǎn),對(duì)于iNOS基因響應(yīng)細(xì)胞因子和脂多糖刺激是重要的。5no合成纖維素,左花紅色目前的研究結(jié)果表明,IFN-γ,TNF-α,IL-1β,IL-2,IL-6,NF-κB和AP-1,GM-CSF等可誘導(dǎo)iNOS表達(dá),促進(jìn)NO合成。而IL-4,IL-8,IL-10,IL-13,巨噬細(xì)胞滅活因子,表皮生長因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等均可抑制NO合成。這些因子可單獨(dú)影響NO合成,也可以協(xié)同作用,單獨(dú)作用時(shí)對(duì)NO合成的影響不明顯,與LPS合用或幾種細(xì)胞因子協(xié)同作用時(shí)產(chǎn)生明顯作用。它們通過影響iNOS轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和后翻譯機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、iNOS的穩(wěn)定性或iNOS的催化活性,促進(jìn)或抑制NO合成。6no與接觸性皮炎,在發(fā)生和治療前后,no是被檢測(cè)的患者之一,其分類越來越多的研究報(bào)道顯示,NO與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系,其合成的關(guān)鍵酶NOS具有重要作用,其中iNOS的研究最為廣泛。多種疾病的發(fā)生發(fā)展均伴隨有NO濃度變化,并與iNOS活性高低有關(guān)。6.1炎癥和免疫疾病炎癥過程中NO既是有益也是有害分子,cNOS產(chǎn)生維持生理活性低水平的NO,iNOS產(chǎn)生大量NO,NO自由基通過刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)受感染細(xì)胞的炎癥和死亡,起到對(duì)抗外源性微生物的細(xì)胞毒作用。另一方面,它還通過促進(jìn)周邊非損傷細(xì)胞的炎癥或細(xì)胞毒性,加劇膿毒癥、超敏反應(yīng)或自身免疫的組織損傷。在皮膚角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗氏細(xì)胞和其它的樹狀突細(xì)胞里都有iNOS合成的NO存在。除了可能有對(duì)抗外來侵略的益處外,關(guān)于它與皮膚炎癥和免疫反應(yīng),即與接觸性皮炎,包括過敏性接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎、異位性皮炎和銀屑病的關(guān)系的報(bào)道增加。6.2腫瘤越來越多研究顯示,根據(jù)NO的局部濃度,可能有一個(gè)雙重的促進(jìn)或者抗癌抗菌作用。高濃度NO(如由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO),可能介導(dǎo)癌細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡和抑制腫瘤生長。盡管在相對(duì)低濃度的NO(如許多不同類型的臨床腫瘤標(biāo)本的可測(cè)量的濃度),腫瘤生長、增殖和血管發(fā)生都被促進(jìn)。6.3急性肺損傷動(dòng)物模型和人體內(nèi)急性肺損傷(ALI)均具有特征性的上調(diào)iNOS并增加NO產(chǎn)生。iNOS來源的NO有助于ALI病理生理特征產(chǎn)生,而且iNOS來源的NO在ALI肺泡液的清除方面也有復(fù)雜的影響,表現(xiàn)為早期抑制清除,隨后氣管產(chǎn)生內(nèi)毒素后增加清除。大多數(shù)肺細(xì)胞類型,包括實(shí)質(zhì)細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓來源炎癥細(xì)胞如中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,可以釋放iNOS來源的NO。6.4胰島素抵抗iNOS基因靶向斷裂被發(fā)現(xiàn)保護(hù)高脂飼養(yǎng)的肥胖大鼠不產(chǎn)生胰島素抵抗,顯著提高葡萄糖耐受量。而在遺傳肥胖大鼠的骨骼平滑肌內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)增加。不是全部,至少大部分胰島素抵抗的誘導(dǎo)器(如:肥胖癥、游離脂肪酸、高血糖、腫瘤壞死因子α(TNF-α)氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素和燒傷等)增加iNOS的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)特別是在增加氧化應(yīng)激包括肥胖癥的條件下,iNOS可能通過增加胰島素受體IRS-1降解加劇胰島素抵抗。6.5脂解作用在體外NO供體刺激基底部的脂解作用,但阻斷異丙腎上腺素刺激的脂解作用,而在活體內(nèi)NOS抑制劑N(G)-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)增加脂解作用。iNOS可作為一種脂解作