微生物在納米生物合成中的應(yīng)用

微生物在納米生物合成中的應(yīng)用

納米生物合成技術(shù)是指由生物活性分子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外自生物活性分子中或細(xì)胞外自生物活性分子組成的新型納米技術(shù)。近年來，它是納米技術(shù)、生物技術(shù)和科學(xué)研究的接口，并發(fā)展起來。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)納米合成技術(shù)相比,納米生物合成技術(shù)清潔、無毒、環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展,反應(yīng)條件溫和可控,不需添加任何還原劑,效率高等優(yōu)點成為納米合成領(lǐng)域研究熱點。由于富含蛋白質(zhì)、脂類、多聚糖等生物物質(zhì),賦予納米材料獨特的生物學(xué)特性,使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及材料學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。微生物在自然界分布廣,易分離培養(yǎng),生長繁殖快,結(jié)構(gòu)簡單易于操作,已廣泛用于納米材料生物合成研究,并取得了較大的研究進(jìn)展。本文對細(xì)菌、放線菌、酵母菌以及真菌等微生物合成納米材料的生物方法、合成機制、納米材料形貌和尺寸微生物調(diào)控合成方法以及生物納米材料應(yīng)用進(jìn)行了評述,旨在為我國該領(lǐng)域的研究提供參考。1納米生物合成技術(shù)微生物代謝類型多,具有極強的生命力和適應(yīng)性,在自然界分布廣,最早被應(yīng)用于納米生物合成技術(shù)的生物類群。納米材料微生物合成研究最早可追溯到1989年,Nature雜志首先報道了光滑念珠菌(Candidaglabrata)合成細(xì)胞內(nèi)CdSe納米材料的生物合成方法。1993年,Science雜志報道了磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)礦化合成磁納米顆粒(Fe3O4)研究。2001年,NanoLett雜志發(fā)表文章報道了尖孢鐮刀霉(Fusariumoxysporum)合成細(xì)胞內(nèi)Ag納米顆粒的生物合成方法,并首次提出納米生物合成技術(shù)概念。隨后,美國化學(xué)會以及歐洲權(quán)威學(xué)術(shù)雜志也紛紛發(fā)表文章報道納米材料生物合成技術(shù)。納米生物合成技術(shù)由此引起納米合成研究者極大興趣,成為納米技術(shù)研究熱點。近年來,國內(nèi)也有多個研究小組開展相關(guān)工作,并取得了一些可喜成績。目前,細(xì)菌(Bacteria)、酵母菌(Yeast)、真菌(Fungi)等多種微生物應(yīng)用于納米材料合成研究;包括球形、三角形、菱形、立方體以及納米線等多種形貌的Au、Ag、磁等金屬納米材料,Silica等半導(dǎo)體無機納米材料,CdSe、CdS等量子點納米材料,以及Au-Ag、BaTiO3等合金納米材料可被微生物合成;粒徑多分布在1-200nm;具有單晶或多晶典型的納米晶體結(jié)構(gòu)。表1總結(jié)了近年來用于納米生物合成技術(shù)的微生物及其合成的納米材。2納米材料基因合成方法根據(jù)微生物合成特點及納米材料性質(zhì),已報道的微生物合成納米材料方法主要分為三類。根據(jù)合成的納米材料屬性可分為金屬納米材料、半導(dǎo)體納米材料及雙金屬復(fù)合納米材料微生物合成方法;根據(jù)合成方式分為細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外微生物合成方法;根據(jù)細(xì)胞活性分為活細(xì)胞生物合成與死細(xì)胞或者細(xì)胞溶解物的合成方法。目前,各類微生物合成納米材料的應(yīng)用水平不盡相同,細(xì)菌和真菌研究較為深入。2.1-20nm細(xì)胞內(nèi)au納米顆粒生物合成細(xì)菌生物合成納米材料反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)量高,納米材料易純化,被稱為“納米材料加工廠”。比較而言,利用活細(xì)菌合成包括金屬與非金屬納米材料的生物方法研究較多。當(dāng)活細(xì)菌與溶液金屬或非金屬離子共孵育,菌體吸收或吸附溶液金屬或非金屬離子,利用生物活性分子細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外自組裝具有典型的單晶或者多晶結(jié)構(gòu)特征的納米材料。已報道細(xì)菌合成的納米材料包括Au、Ag、Pa、磁、ZnS、CdS等。B.subtilis168菌株與氯金酸溶液共孵育后,細(xì)胞可合成5-25nm八面體Au顆粒,TEM表征發(fā)現(xiàn)納米顆粒分布于細(xì)胞周質(zhì)空間或包埋在細(xì)胞壁,與菌體形成Au-細(xì)菌復(fù)合體。厭氧條件下,S.algae與氯金酸溶液共孵育可合成細(xì)胞內(nèi)納米Au顆粒。室溫條件下,Lactobacillussp.與氯金酸溶液孵育可合成20-50nm細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒,呈簇分布,形貌多樣,產(chǎn)量達(dá)35%細(xì)胞干重,這為大規(guī)模生產(chǎn)提供了很好基礎(chǔ)。當(dāng)200℃加熱Au納米顆粒時,顆粒可被分解為Au原子,表明了生物活性物質(zhì)參與Au+還原與納米顆粒的組裝。不添加任何穩(wěn)定劑或者表面吸附劑等輔助分子條件下,R.capsulate(已更名為R.capsulatus)及菌體溶解物與Au+共孵育均可合成Au納米顆粒。當(dāng)改變氯金酸與細(xì)胞溶解物濃度比,還可選擇性自組裝成Au納米線,這也是首次報道Au納米線生物組裝方法。趨磁細(xì)菌M.gryphisnaldense最早被發(fā)現(xiàn)可細(xì)胞內(nèi)合成和組裝磁性納米顆粒(BMPS,又稱磁小體),趨磁細(xì)菌可選擇性吸收溶液中Fe3+,轉(zhuǎn)入細(xì)胞后被還原,與細(xì)胞內(nèi)磁小體被膜組裝成5-120nm的磁小體,主要成分為Fe3O4和Fe3S4,基本不含其他雜質(zhì);磁小體呈順磁性,鏈狀(單鏈或多鏈)排列;正方形、長方形、菱形、六邊形和子彈頭形多種形態(tài)(圖1)。銀耐受菌首先用于Ag納米顆粒生物合成。例如,石油脫硫菌P.stutzeriAG259與Ag+溶液孵育后,細(xì)胞內(nèi)合成35-46nmAg納米顆粒,顆粒為球形、三角形和六角形等多種形貌;EDX分析表明納米顆粒為純Ag組成。SilverS等報道銀耐受菌與Ag+溶液共孵育后,細(xì)胞內(nèi)還原與組裝的Ag納米顆粒產(chǎn)量可達(dá)25%細(xì)胞干重,為生物來源的銀納米材料大量合成提供很好方法。最令人振奮的納米生物合成技術(shù)之一是實現(xiàn)發(fā)光量子點(Quantumdots,QDs)的生物合成。量子點是一種具有獨特發(fā)光性質(zhì)無機半導(dǎo)體納米晶體,其發(fā)光特性與有機熒光染料和熒光蛋白相比,具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄且、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像和樣品檢測。通常只能采用化學(xué)方法合成,合成條件苛刻,產(chǎn)量低,而且具有環(huán)境毒性。與其他微生物比較,細(xì)菌用于量子點合成種類最多。如,C.thermoaceticm與CdCl2共培養(yǎng)可在其細(xì)胞壁合成CdS量子點納米材料。K.aerogenes合成20-200nm的CdS納米材料。E.coil合成細(xì)胞內(nèi)CdS量子點納米材料,其合成產(chǎn)量受細(xì)胞周期影響。硫還原菌合成細(xì)胞外2-5nm單分散性ZnS量子點納米顆粒。2.2au納米顆粒的合成與細(xì)菌相比,放線菌(Actinomycete)應(yīng)用于納米生物合成研究比較晚,目前僅Rhodococcussp.及Thermomonosporasp.用于納米材料生物合成。Rhodococcussp.菌絲與氯金酸溶液孵育后,在細(xì)胞內(nèi)合成5-15nm球形的Au納米顆粒,TEM表征發(fā)現(xiàn)顆粒分布于細(xì)胞膜。Thermomonosporasp.與氯金酸溶液孵育后,在細(xì)胞外組裝7-12nmAu納米顆粒;FTIR分析以及生化分析表明Au顆粒存在至少4種蛋白酶,分子量為80-10kDa。2.3形成新材料的生物合成粒徑酵母菌用于納米材料的生物合成研究比較早,可能受1989年DameronCT利用酵母菌細(xì)胞合成量子點研究影響,迄今為止,酵母菌主要用于量子點納米材料生物合成。隨著研究逐漸深入,表明了以活酵母細(xì)胞作為生物反應(yīng)器合成出尺寸可控、閃閃發(fā)光的量子點,為生物合成量子點提供很好材料。一般方法,將酵母菌與一定濃度Pb2+、Cd2+、Cd2+、Zn2+等離子溶液共孵育,菌體吸收或吸附溶液中離子后,生物還原與組裝具有特定光譜性質(zhì)的量子點納米晶體顆粒。包括光滑念珠菌在內(nèi),已有多種酵母菌合成量子點納米材料的生物方法報道。例如,Torulopsissp.合成2-5nm細(xì)胞內(nèi)PbS納米晶,330nm存在紫外特征吸收峰。S.cerevisae生物合成粒徑8-35nm細(xì)胞內(nèi)TiO2納米顆粒。室溫條件下,S.pombe合成1-1.5nm細(xì)胞內(nèi)CdS。最新報道,利用活的酵母菌細(xì)胞作為生物發(fā)生器,生物合成了發(fā)出紅、黃、綠不同熒光的量子點CdSe,等等。2.4ag-q-ms/au-ag復(fù)合納米顆粒真菌用于合成納米材料是近年來發(fā)展的生物合成方法。已生物合成Au、Ag、磁、Titanium等金屬納米材料、Silica等半導(dǎo)體納米材料以及CdS、CdSe量子點納米材料。更有科學(xué)意義是利用真菌生物合成包括Au-Ag、BaTiO3復(fù)合納米材料。不僅實現(xiàn)了生物合成方法的重大突破,同時拓展了生物合成納米材料種類。目前,報道用于生物合成的真菌有F.oxysporum、Verticilliumsp.、A.oryzaevar.viridis、Penicilliumsp.以及P.brevicompactumWA2315、Volvariellavolvacea等。F.oxysporum為真菌合成納米材料模式菌株,已合成多種金屬、半導(dǎo)體以及復(fù)合納米材料。通常,將F.oxysporum與金屬、非金屬離子溶液共孵育后,菌體可細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外合成金屬、半導(dǎo)體及量子點納米材料。溶液同時存在AuCl4+及Ag+時,F.oxysporum分泌以NADH為輔酶的蛋白酶還原AuCl4+及Ag+,并細(xì)胞外組裝Au-Ag復(fù)合納米顆粒,X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)分析表明Au-Ag復(fù)合納米顆粒同時含有Au及Ag元素。此外,黃曲霉(A.oryzaevar.viridis)及其菌絲溶解物用于Ag納米材料的生物合成,生物學(xué)效應(yīng)研究還表明,生物Ag納米材料顆粒同樣對S.aureusKCCM12256有較強的抑菌作用。P.brevicompactumWA2315與Ag+共孵育可合成粒徑為58±17nm細(xì)胞外Ag納米顆粒,在420nm有特征吸收峰。V.volvacea菌絲溶解物可生物合成Au、Ag納米顆粒以及Au-Ag雙金屬復(fù)合納米顆粒。3磁小體膜囊及磁藥物的作用目前,雖有多種微生物合成金屬、非金屬以及量子點和雙金屬復(fù)合納米材料的方法報道,但微生物活細(xì)胞及其細(xì)胞溶解物如何實現(xiàn)金屬、非金屬、量子點以及雙金屬復(fù)合納米材料的自主裝的機制尚不完全清楚。普遍觀點認(rèn)為微生物或細(xì)胞溶解物與金屬以及非金屬離子共孵育后,生物活性物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、還原糖、還原性谷胱甘肽等生物活性分子對金屬以及非金屬離子進(jìn)行富集、還原并組裝成具有典型納米晶體結(jié)構(gòu)的納米材料,生物分子對納米晶體穩(wěn)定起著重要作用。而已有的研究表明,微生物合成納米材料是一種非常復(fù)雜的生物化學(xué)過程,特別是活細(xì)胞的生物合成過程,不同的納米材料生物合成機制各異。例如,Magnetospirillumsp.AMB-1菌株細(xì)胞內(nèi)組裝磁小體機理研究表明,磁小體形貌、顆粒尺寸、細(xì)胞內(nèi)排列方式等均受菌體基因表達(dá)調(diào)控。趨磁細(xì)菌與Fe3+孵育后,細(xì)胞受刺激首先合成磁小體膜囊(Magnetosomemembrane,MM),被吸收的Fe3+在細(xì)胞內(nèi)被還原為Fe2+,然后轉(zhuǎn)運入磁小體膜囊;Fe2+在此被氧化為Fe3+離子,形成水合Fe3+(Ferrihydrite),MM對磁小體形成與裝配起著關(guān)鍵作用。電子斷層掃描術(shù)(Cryo-electrontomography,cryo-ET)研究表明,MM含有大量來源于細(xì)胞膜的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油等氨基化脂肪酸物質(zhì)。同時,蛋白二維電泳、氨基酸Edman及串聯(lián)式質(zhì)譜等分析表明MM存在18種主要蛋白,占菌體總蛋白的0.1%,MMPs對離子轉(zhuǎn)運、晶體成核和生長等非常重要。例如,分子量分布在15-19kDa的manC、mamF、mms16蛋白在MM中含量高,且穩(wěn)定,與MM松弛結(jié)合,主要穩(wěn)定MM。而manB和manM蛋白對陽離子的運輸有重要調(diào)控作用。mamE和mamO蛋白主要作用為促進(jìn)磁小體的形成和成熟。此外,大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成CdS納米晶體機制研究表明,細(xì)胞還原性巰基化合物(Reducedthiols)及谷胱甘肽(Glutathione)對CdS納米晶體合成具有重要作用,對數(shù)期及穩(wěn)定期細(xì)胞還原性巰基化合物及谷胱甘肽含量高于衰亡期細(xì)胞,因而檢測表明對數(shù)期細(xì)胞合成的CdS產(chǎn)量為衰亡期產(chǎn)量20倍。光滑念珠菌(C.glabrata)合成CdS納米材料機制研究表明,當(dāng)細(xì)胞與Cd2+溶液共孵育后,細(xì)胞首先合成螯合素酶(PCs,(γ-Glu-Cys)n)生物活性物質(zhì),PC與Cd2+結(jié)合,形成Cd-PC復(fù)合物被運送到細(xì)胞內(nèi)形成的囊泡,在此Cd-PC復(fù)合物被降解,CdS晶體在囊泡中形成。F.oxysporum細(xì)胞外合成納米材料機制研究表明,菌體主要分泌了4種依賴ATP和NADH胞外酶,分子量為80-10kDa。蛋白酶對納米材料成核、大小和形貌起著重要作用。為探討真菌合成納米材料的機理,我們選用了Penicilliumsp.、Aureobasidiumpullulan及Fusariumsp.為生物材料,并以F.oxysporum為對照,研究了其細(xì)胞內(nèi)Au納米材料生物合成機制。發(fā)現(xiàn)Penicilliumsp.及A.pullulan主要利用細(xì)胞還原糖為活性物質(zhì)合成Au納米顆粒;Fusariumsp.與F.oxysporum為同屬真菌,均利用細(xì)胞蛋白質(zhì)為活性組分組裝Au納米顆粒,與報道相符。可見,微生物合成納米材料機制的多樣性和復(fù)雜性。4合成au納米顆粒尺寸的調(diào)控眾所周知,納米材料尺寸和形貌對其光譜特性、生物學(xué)效應(yīng)等多種性質(zhì)有重要影響,如何實現(xiàn)納米材料生物調(diào)控合成也成為納米生物合成技術(shù)領(lǐng)域前沿研究課題。納米材料生物合成在生物體系中發(fā)生,具有生物系統(tǒng)性特點,特別是活細(xì)胞生物合成反應(yīng),因而其調(diào)控方式不同于物理化學(xué)方法。研究結(jié)果表明,溫度、離子強度、溶液pH等對微生物生長有重要影響的因素對微生物合成納米材料尺寸有調(diào)控作用。例如,我們利用溫度調(diào)控Penicilliumsp.合成細(xì)胞內(nèi)Au納米顆粒研究表明,溫度可實現(xiàn)對Au納米顆粒尺寸調(diào)控(圖2)。當(dāng)Penicilliumsp.在處于4℃合成條件,菌體合成了4-10nm單分散性球形Au納米顆粒;處于28℃合成溫度,菌體可合成20-37nm的單分散性球形Au納米顆粒;而在20-30℃波動的合成溫度條件下,菌體合成了粒徑分布為16-110nm多分散性的Au納米顆粒;機理研究表明,溫度主要影響細(xì)胞對AuCl4+吸收速度,從而調(diào)控AuCl4+在細(xì)胞內(nèi)還原和Au成核,進(jìn)而可控Au納米顆粒尺寸。此外,pH值調(diào)控S.algae合成Au納米顆粒研究表明,溶液pH值對顆粒粒徑有調(diào)控作用。當(dāng)溶液pH值為7時,菌體可合成10-20nm細(xì)胞內(nèi)Au顆粒;溶液pH降低至1時,則形成50-500nm細(xì)胞外Au顆粒。Ag+濃度對P.stutzeriAG259合成Ag納米顆粒尺寸有重要影響,低濃度的Ag+濃度,菌體可積累35-46nmAg納米顆粒,菌體與高濃度Ag+環(huán)境孵育,可合成200nm左右或更大的Ag顆粒。5在生物檢測方面的應(yīng)用生物合成納米材料富含蛋白質(zhì)、脂類、多聚糖等生物物質(zhì)使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及材料學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。目前,僅磁小體的應(yīng)用研究相對比較成熟。人們首先發(fā)現(xiàn)磁小體對磁場非常敏感,可在磁細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)排列成磁陣列的特