大鼠下丘腦室旁核內(nèi)一氧化氮合酶與催產(chǎn)素的定位

大鼠下丘腦室旁核內(nèi)一氧化氮合酶與催產(chǎn)素的定位

氧氣氮（no）是一種新型的原子信使。中樞神經(jīng)系統(tǒng)還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH-d)已被證明是一氧化氮合酶(NOS)的輔酶;NADPH-d組織化學(xué)提供了一種簡(jiǎn)便而可靠的標(biāo)記NOS神經(jīng)元的方法。既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下丘腦內(nèi)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元在不同核團(tuán)內(nèi)的分布與形態(tài)有差異性:室旁核與視上核內(nèi)主要為大細(xì)胞型NOS神經(jīng)元,而弓狀核、視交叉上核等核團(tuán)內(nèi)主要為小細(xì)胞型NOS神經(jīng)元。這兩種神經(jīng)元與其他神經(jīng)遞質(zhì)(神經(jīng)激素)的共存是否存有差異,值得進(jìn)一步研究。本文詳細(xì)觀察下丘腦室旁核內(nèi)(PVN)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元與催產(chǎn)素(OXY)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的分布,證實(shí)兩者分布基本一致,高度共存。并且觀察到第三腦室周圍部分觸液神經(jīng)元內(nèi)NOS與OXY共存,為闡明NOS、OXY與生殖及性行為的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。1免疫組化染色雌雄SD大鼠6只,體重180～250g。按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法灌注、取材,將含下丘腦的組織塊在恒冷箱作冠狀連續(xù)切片(厚25μm),分4組貼片:①中性紅染色組;②NADPH-d組織化學(xué)染色組;③OXY免疫組織化學(xué)染色組;④NADPH-d+OXY雙標(biāo)染色組。染色:①組切片常規(guī)中性紅染色;②與④組切片加入反應(yīng)液37℃避光孵育45min,反應(yīng)液的組成:0.1mol/L磷酸緩沖液(PB),pH8.0,含0.3%TirtonX-100,0.6g/L硝基四氮唑藍(lán)(NBT,南京建成生物試劑公司),0.5g/LNADPH-d(Sigma產(chǎn)品),反應(yīng)后用pH7.4的PBS充分漂洗。④與③組一同進(jìn)行OXY免疫組織化學(xué)反應(yīng):切片經(jīng)正常羊血清(1∶200)處理30min,然后入第一級(jí)兔抗OXY血清(1∶1000)(Sigma產(chǎn)品)4℃孵育72h,經(jīng)PBS漂洗,行ABC(Vector產(chǎn)品)免疫反應(yīng),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)∶H2O2溶液(0.05%∶0.01%)室溫孵育約15min,再經(jīng)PBS漂洗終止反應(yīng)。對(duì)上述切片脫水、透明、封片、光鏡觀察、計(jì)數(shù)、攝片。另取一只鼠腦冠狀連續(xù)切片,分4組作對(duì)照試驗(yàn),分別作以下反應(yīng):抗體交叉試驗(yàn)①空白試驗(yàn):分別省去兩套染色中的NADPH-d、兔OXY血清,分別孵育切片。②置換試驗(yàn):用正常兔血清代替第2套染色中的兔抗OXY血清。呈色混合試驗(yàn)在第1套染色程序結(jié)束后,切片經(jīng)PBS漂洗,然后直接進(jìn)行第2套染色程序中的DAB/H2O2呈色步驟,證實(shí)在第1套染色程序后是否有殘余的NADPH-d、NBT與第2套程序中的DAB反應(yīng)而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物混雜。2免疫反應(yīng)對(duì)照試驗(yàn)分別省去NADPH-d、兔抗OXY血清,不出現(xiàn)相應(yīng)的染色陽(yáng)性結(jié)果。用正常兔血清代替第2套染色中的兔抗OXY血清,也不出現(xiàn)陽(yáng)性免疫反應(yīng),表明本實(shí)驗(yàn)無(wú)抗體交叉反應(yīng)存在。呈色混合試驗(yàn)陰性,表明兩套反應(yīng)程序之間不互相干擾,具有一定的特異性。2.1外側(cè)部樹突單極體雙極端NOS陽(yáng)性神經(jīng)元有兩種類型:大細(xì)胞型,占大多數(shù),胞體主要呈圓形、橢圓形或梭形,細(xì)胞質(zhì)染色呈深紫藍(lán)色,主要集中分布于PVN的外側(cè)部,樹突為雙極或單極,胞體和突起的極性為背外腹內(nèi)向。近腹側(cè)的突起較長(zhǎng),相互交織成神經(jīng)叢,走向腹內(nèi)側(cè)的第三腦室,并與腦室附近NOS陽(yáng)性觸液神經(jīng)元相交錯(cuò)、鄰接。小細(xì)胞型,占少數(shù),胞體呈橢圓形或梭形,細(xì)胞質(zhì)染色呈淺紫藍(lán)色,多散在分布于PVN的內(nèi)側(cè)部。在靠近第三腦室處,有少許大型的NOS陽(yáng)性觸液神經(jīng)元,胞體呈橢圓形、梭形、多角形或倒置梨形細(xì)胞(圖1,見封二)。2.2免疫陽(yáng)性觸液神經(jīng)元PVN內(nèi)OXY免疫陽(yáng)性神經(jīng)元同NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分布類似,呈楔形集中分布于PVN的外側(cè)部,內(nèi)側(cè)部細(xì)胞密度低于NOS,但在靠近第三腦室處,也有少許OXY免疫陽(yáng)性觸液神經(jīng)元。OXY免疫陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)也類似,主要為圓形或橢圓形,但突起較短,著色不明顯(圖2,見封二)。2.3pvn內(nèi)nos/ox雙標(biāo)神經(jīng)元/表達(dá)變化雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,PVN內(nèi)含有3種陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元,紫藍(lán)色的NOS單標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元、棕黃色的OXY單標(biāo)記免疫陽(yáng)性神經(jīng)元、NOS/OXY雙標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元。雙標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,外周的細(xì)胞質(zhì)與突起呈紫藍(lán)色,兩者比例各細(xì)胞間存有差異。PVN內(nèi)NOS/OXY雙標(biāo)神經(jīng)元集中分布于PVN的外側(cè)部,內(nèi)側(cè)部偶見,但在靠近第三腦室處,亦見少許嵌于室管膜細(xì)胞之間呈倒置梨形的大型雙標(biāo)神經(jīng)元(圖3,見封二)。對(duì)4套染色最佳的雙標(biāo)切片內(nèi)陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),結(jié)果:雙標(biāo)神經(jīng)元約占87%;OXY單標(biāo)記神經(jīng)元約占3.6%,散在分布PVN外側(cè)部;NOS單標(biāo)記神經(jīng)元約占9.4%,一部分為大細(xì)胞型NOS神經(jīng)元,集中分布于PVN外側(cè)部的腹側(cè),突起較長(zhǎng),相互交織,另一部分為散在分布于內(nèi)側(cè)部的小細(xì)胞型NOS神經(jīng)元。3nos與o統(tǒng)一在pvn細(xì)胞中的表達(dá)筆者既往的研究表明,下丘腦內(nèi)的NOS陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元,應(yīng)分為兩種類型:一類為大細(xì)胞型NOS標(biāo)記神經(jīng)元,細(xì)胞體積較大、細(xì)胞質(zhì)深染,多位于下丘腦大細(xì)胞神經(jīng)分泌系統(tǒng);另一類型為小細(xì)胞型NOS標(biāo)記神經(jīng)元,細(xì)胞體積小、細(xì)胞質(zhì)染色淡。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)OXY免疫陽(yáng)性神經(jīng)元均為大細(xì)胞型分泌神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)觀察到分布于PVN外側(cè)部的大細(xì)胞型NOS神經(jīng)元與OXY具有高度的共存關(guān)系,故可以比較肯定地認(rèn)為大細(xì)胞型NOS標(biāo)記神經(jīng)元屬于大細(xì)胞型分泌神經(jīng)元。而小細(xì)胞型NOS型標(biāo)記神經(jīng)元主要分布在弓狀核視交叉上核等下丘腦小細(xì)胞神經(jīng)分泌核團(tuán),除與去甲腎上腺素、多巴胺、Υ-氨基丁酸具有共存關(guān)系外,尚與β-內(nèi)啡肽部分共存(待整理發(fā)表)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,NOS與OXY在下丘腦PVN的神經(jīng)元內(nèi)具有高度共存性:絕大部分OXY免疫陽(yáng)性神經(jīng)元均含NOS陽(yáng)性標(biāo)記物,而大部分NOS陽(yáng)性大型神經(jīng)元其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亦可見OXY免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物。近幾年來(lái)機(jī)能學(xué)方面的研究證實(shí)NO參與調(diào)節(jié)OXY的合成與分泌,亦有文獻(xiàn)報(bào)道OXY可以間接調(diào)節(jié)NO的釋放,所有這些研究都證實(shí)了在生殖與性行為調(diào)節(jié)方面,二者具有協(xié)同累加效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察到二者具有高度共存性,為這些研究結(jié)果提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。另外,本實(shí)驗(yàn)觀察到在與PVN相對(duì)的第三腦室有NOS陽(yáng)性觸液神經(jīng)元、OXY免疫陽(yáng)性觸液神經(jīng)元及OXY/NOS雙標(biāo)記陽(yáng)性觸液神經(jīng)元存在。對(duì)于第三腦室NOS陽(yáng)性觸液神經(jīng)元的分布與形態(tài),筆者已作詳細(xì)報(bào)道。由于OXY/NOS雙標(biāo)記陽(yáng)性觸液神經(jīng)元與腦室關(guān)系密切,在腦與腦脊液神經(jīng)體液回路中可起“信息中轉(zhuǎn)站”作用。如向第三腦室注射左旋精氨酸(NO供體),可促進(jìn)大鼠陰莖勃起、增加射精頻數(shù)與精子數(shù)目,而注射NOS抑制劑NG-L-精氨酸甲酯則可逆轉(zhuǎn)上述作用。楊寵等的研究已經(jīng)證實(shí)了第三腦室室周區(qū)的OXY神經(jīng)元可向垂體后葉投射,OXY免疫陽(yáng)性觸液神經(jīng)元在腦脊液與垂體后葉之間起功能上的聯(lián)系作用,腦脊液可影響垂體后葉的OXY