醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗

醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗國家食品藥品監(jiān)視管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)視檢驗中心用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械能否無菌的一種方法。假設(shè)供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅闡明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌實驗的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培育基內(nèi)，以檢驗供試品能否有細菌和真菌污染。什么是無菌檢查法？醫(yī)療器械無菌檢驗規(guī)范GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學(xué)實驗方法2021年版<中國藥典>無菌檢查法醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南〔2021版〕無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品消費控制過程中的一項重要內(nèi)容。其檢驗方法、檢驗結(jié)果斷定及檢驗人員業(yè)務(wù)才干等要素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和平安。作為無菌醫(yī)療器械消費企業(yè)，其無菌檢驗任務(wù)應(yīng)由本企業(yè)獨立完成。并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程。

培育基:是人工配制的生物營養(yǎng)物質(zhì)，即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長繁衍的需求配成的一種混合營養(yǎng)物。微生物:必需用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才干察看到的微小生物。微生物具有一定的形狀與構(gòu)造,并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁衍,如細菌、病毒、真菌等。無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。凡能殺滅物體中一切活的微生物的作用稱為滅菌。

細菌：為單細胞微生物,其細胞分化不完善，無完好細胞核及核膜、核仁，直徑普通為1μm~10μm。

真菌：為多細胞或單細胞微生物，其細胞分化完善，有細胞核和各種細胞器，故易在體外生長繁衍，直徑普通為10μm~100μm。醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備超凈任務(wù)臺醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備恒溫培育箱〔至少2臺〕醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備壓力蒸汽滅菌器醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備電熱枯燥箱醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備集菌儀醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備生物平安柜:〔從實驗平安性思索，建議陽性對照實驗運用生物平安柜〕醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備電子天平醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備光學(xué)顯微鏡醫(yī)療器械無菌檢驗所需設(shè)備過濾安裝〔無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子〕無菌檢查應(yīng)在環(huán)境干凈度10000級下的部分干凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進展，其全過程必需嚴厲遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、任務(wù)臺面及環(huán)境應(yīng)定期按<醫(yī)藥工業(yè)干凈室〔區(qū)〕懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法>的現(xiàn)行國家規(guī)范進展干凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進展驗證，其內(nèi)部環(huán)境的干凈度須符合無菌檢查的要求。無菌檢查人員必需具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。還應(yīng)該具有高度的責任心和嚴謹細致的任務(wù)作風。環(huán)境及人員要求

無菌檢查法環(huán)境要求隔離系統(tǒng)無菌檢查法環(huán)境要求無菌室在消毒處置終了后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。無菌檢查法環(huán)境要求TSA瓊脂平皿在30℃~35℃培育48h證明無菌取3只放無菌操作臺或超凈任務(wù)臺平均位置翻開上蓋，暴露30min后蓋好3只培育皿上生長的菌落數(shù)平均應(yīng)不超越1個無菌實驗過程中也應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法要求同上無菌檢查法實驗前預(yù)備器具滅菌：與供試液接觸的一切器具應(yīng)采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min，或置電熱枯燥箱內(nèi)160℃2h。培育基：可按藥典中的處方制備培育基，亦可運用按該處方消費的符合規(guī)定的脫水培育基。應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培育基應(yīng)保管在2℃~25℃，普通在3周內(nèi)運用。無菌檢查法實驗前預(yù)備配制培育基所需器具:

無菌檢查法實驗前預(yù)備常用器具與稀釋液:

無菌檢查法實驗前預(yù)備培育基:

無菌檢查法實驗前預(yù)備硫乙醇酸鹽流體培育基:在供試品接種前,培育基氧化層的高度不得超越培育基深度的1/5，否那么,須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消逝〔不超越20分鐘〕迅速冷卻,只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培育終了后培育基氧化層〔粉紅色〕不超越培育基深度的1/2。30℃~35℃培育14天。需氧菌生長厭氧菌生長無菌檢查法實驗前預(yù)備培育基:

無菌檢查法實驗前預(yù)備

改良馬丁培育基：23℃~28℃培育14天無菌檢查法實驗前預(yù)備培育基:

無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培育基及改良馬丁培育基等應(yīng)符合培育基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。

無菌性檢查

每批培育基隨機不少于5支〔瓶〕，培育14天，應(yīng)無菌生長。培育基的適用性檢查靈敏度檢查：

菌種

培育基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超越5代〔從菌種保管中心獲得的冷凍枯燥菌種為第0代〕，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證實驗菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌〔Staphylococcus

aureus)［CMCC〔B〕26

003］

銅綠假單胞菌

(Pseudomonas

aeruginosa)

［CMCC〔B〕10

104］

枯草芽孢桿菌

(Bacillus

subtilis

)

［CMCC〔B〕63

501］

生孢梭菌

(Clostridiumsporogenes)

[CMCC(B)

64

941]

白色念珠菌

(Candidaalbicans)

[CMCC(F)

98

001]黑曲霉

(Aspergillus

niger

)

[CMCC(F)

98

003]培育基的適用性檢查培育基應(yīng)符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進展。靈敏度檢查所用菌種〔藥典2021版規(guī)定〕金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新穎培育物至相應(yīng)培育基中培育，將培育物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液〔濃度小于100cfu/mL〕硫乙醇酸鹽流體培育基〔12mL〕9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，另一支不接種做空白對照，培育3天改良馬丁培育基〔9mL〕5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對照，培育5天逐日察看結(jié)果：空白對看管應(yīng)無菌生長，假設(shè)加菌的培育基管均生長良好，那么靈敏度符合規(guī)定。無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培育基內(nèi)培育。薄膜過濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁衍,所以用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果,但并不等于產(chǎn)品中沒有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細菌等微生物截留在濾膜上,然后再經(jīng)過處置培育使所含微生物生長繁衍,從而使微生物檢出。方法驗證實驗當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應(yīng)進展方法的驗證，以證明所采用的方法適宜于該產(chǎn)品的無菌檢查。假設(shè)產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改動時，檢查方法應(yīng)重新驗證。

驗證時，按“供試品的無菌檢查〞的規(guī)定及以下要求進展操作。對每一實驗菌應(yīng)逐一進展驗證。方法驗證實驗菌種及菌液制備：除大腸埃希菌〔Escherichiacoli〕[CMCC(B)44102〕外，金黃色葡萄球菌

、

枯草芽孢桿菌

、

生孢梭菌、

白色念珠菌、黑曲霉同培育基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。方法驗證實驗與靈敏度檢驗一切菌種區(qū)別：大腸埃希菌替代銅綠假單胞菌。方法驗證實驗取每種培育基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中參與小于100cfu的實驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培育基或改良馬丁培育基中，或?qū)⑴嘤又翞V筒內(nèi)。另取一裝有同體積培育基的容器，參與等量實驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培育3天~5天。各實驗菌同法操作。方法驗證實驗：薄膜過濾法方法驗證所用菌種〔藥典2021版規(guī)定〕金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新穎培育物至相應(yīng)培育基中培育，將培育物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液〔濃度小于100cfu/mL〕硫乙醇酸鹽流體培育基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培育基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培育3天。改良馬丁培育基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培育基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培育5天。方法驗證實驗：直接接種法與對看管比較，如含供試品各容器中的實驗菌均生長良好，那么闡明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進展供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，那么闡明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用添加沖洗量，或添加培育基的用量，或運用中和劑或改換濾膜種類等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進展方法驗證。

方法驗證實驗也可與供試品的無菌檢查同時進展。方法驗證實驗：結(jié)果判別供試品包裝須完好無損，尤其是只需一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品假設(shè)有兩層〔或兩層以上〕包裝的，需將外包裝在傳送窗〔或緩沖間〕撤除后，傳入實驗室。

操作人員預(yù)備：帶口罩、帽子、穿公用無菌服、鞋進入無菌室。供試品的無菌檢查

供試品的無菌檢查在100級超凈臺內(nèi)，酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培育基〔不少于15ml/管〕和改良馬丁培育基〔不少于10ml/管〕的容器中。正確的無菌操作，既不能引入外來菌污染培育物呵斥假陽性，也要留意接觸供試品的實驗器具溫度不可過高以免將能夠存在的菌燙死。陰性對照〔目的是驗證實驗?zāi)芊翊嬖谖廴尽常汗┰嚻窡o菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。陽性對照〔目的是驗證實驗可靠性，防止假陰性〕：應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性對照實驗的菌液制備同方法驗證實驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培育基接種的樣品量。陽性對看管培育48~72小時應(yīng)生長良好。供試品的無菌檢查無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個~11個單位供試品優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培育基內(nèi)培育。如：棉簽、導(dǎo)尿包中的導(dǎo)尿管、注射器中的液體等無菌檢查法-薄膜過濾法2021年版<中國藥典>規(guī)定:只需供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法一樣。在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品經(jīng)過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑約為50mm。水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立刻過濾。供試液經(jīng)薄膜過濾后，假設(shè)需求用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超越1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。無菌檢查法-薄膜過濾法沖洗后分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培育基及改良馬丁培育基參與相應(yīng)的濾筒內(nèi)，培育。無菌檢查法培育及察看上述含培育基的容器按規(guī)定的溫度培育14天。培育期間應(yīng)逐日察看并記錄能否有菌生長。如在參與供試品后或在培育過程中，培育基出現(xiàn)渾濁，培育14天后，不能從外觀上判別有無微生物生長，可取該培育液適量轉(zhuǎn)種至同種新穎培育基中，細菌培育2天、真菌培育3天，察看接種的同種新穎培育基能否再出現(xiàn)渾濁；或取培育液涂片，染色，鏡檢，判別能否有菌。假設(shè)供試品管均廓清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設(shè)供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。實驗假設(shè)經(jīng)確認無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，假設(shè)無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設(shè)有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。陽性對看管應(yīng)生長良好，陰性對照不得有菌生長。否那么，實驗無效。無菌檢查法結(jié)果判別

當符合以下至少一個條件時，方可判實驗結(jié)果無效：

〔1〕無菌檢查實驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；

〔2〕回想無菌實驗過程，發(fā)現(xiàn)有能夠引起微生物污染的要素。

〔3〕供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌實驗中所運用的物品和〔或〕無菌操作技術(shù)不當引起的。無菌檢查法結(jié)果判別實驗假設(shè)經(jīng)確認無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，假設(shè)無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設(shè)有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。無菌檢查法結(jié)果判別醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南〔2021版〕

由于無菌檢驗時間跨度較長，因此過程的記錄應(yīng)可以完好表達實驗的全過程，對于在實驗過程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。

直接接種法實驗結(jié)果

薄膜過濾法實驗結(jié)果

無菌檢查法斷定實驗報告中宜給出以下信息：供試品稱號；消費批號和〔或〕滅菌批號；供試液制備方法；接種方式；每日察看結(jié)果〔包括陰、陽性對照〕；結(jié)果斷定實驗報告GB15979-2002一次性運用衛(wèi)生用品衛(wèi)生規(guī)范初始污染菌的檢驗初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細菌總數(shù)，可判明檢品受細菌污染的程度以及消費單位所用的原料、工具設(shè)備、工藝流程、消費人員的衛(wèi)生情況，是對檢品進展衛(wèi)生學(xué)評價的綜合根據(jù)。部分一次性運用衛(wèi)消費品微生物學(xué)目的要求產(chǎn)品種類微生物指標初始污染菌cfu/g細菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL大腸菌群致病性化膿菌真菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL口罩普通級消毒級—≤10000≤200≤20不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出≤100不得檢出尿布等普通級消毒級—≤10000≤200≤20不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出≤100不得檢出注：致病性化膿菌指綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。初始污染菌的檢驗預(yù)備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌營養(yǎng)瓊脂培育基配制、滅菌。步驟：采樣，供試液制備，培育，菌落計數(shù)在100級凈化條件下用無菌方法翻開至少3個包裝；從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品；剪碎后參與200mL無菌生理鹽水中，充分混勻。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。初始污染菌的檢驗取上清液共接種5個平皿，每個平皿中參與1mL供試液用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培育基〔15~20〕mL，倒入每個平皿內(nèi)混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置35℃±2℃培育48h后，計算平板上的菌落數(shù)。稀釋度5細菌菌落總數(shù)=5塊平板上的細菌菌落總數(shù)×〔cfu/g或cfu/mL〕如：取10g樣品入200mL生理鹽水中，那么稀釋20倍當菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實有數(shù)報告，大于100時采用二位有效數(shù)字。初始污染菌的檢驗計數(shù)方法：將平板置菌落計數(shù)器或從平板的反面直接以肉眼用標志筆點計，以投射光襯以暗色背景，仔細察看，計數(shù)。必要時可以借助于放大鏡、菌落計數(shù)器。菌落特征：⑴形狀特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色。⑵邊緣整齊或不整齊，外表有光滑、粗糙，皺褶、突起或扁平。⑶大小差別很大。初始污染菌的檢驗假設(shè)樣品菌落總數(shù)超越本規(guī)范的規(guī)定，應(yīng)將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測2次，2次結(jié)果平均值都到達本規(guī)范的規(guī)定，那么斷定被檢樣品合格；其中有任何一次結(jié)果平均值超越本規(guī)范的規(guī)定，那么斷定被檢樣品不合格。醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗相關(guān)規(guī)范GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學(xué)實驗方法2021年版<中國藥典>無菌檢查法GB15979-2002一次性運用衛(wèi)生用品衛(wèi)生規(guī)范GB/T15980-1995一次性運用醫(yī)療用品衛(wèi)生規(guī)范YY0033-2000無菌醫(yī)療器具消費管理規(guī)范〔1〕培育基配制記錄〔2〕滅菌器、天平等儀器的運用記錄〔3〕培育基無菌性檢查、靈敏度檢查記錄〔4〕菌種購買、傳代、運用記錄〔5〕方法學(xué)驗證記錄〔6〕無菌實驗記錄〔7〕滅菌物品制造〔8〕廢棄物處置記錄〔9〕干凈間監(jiān)測記錄醫(yī)療器械無菌檢驗應(yīng)有記錄一、適用范圍二、檢查內(nèi)容1.選擇的無菌檢驗方法2.檢驗人員資質(zhì)3.現(xiàn)場察看無菌實驗室環(huán)境4.設(shè)備和器具5.管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件6.查閱實驗記錄三、其它應(yīng)留意的問題醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南〔2021版〕〔1〕培育基制備〔2〕供試品的無菌檢查〔3〕培育及察看〔4〕結(jié)果判別〔1〕樣品記錄〔2〕滅菌物品制造記錄〔3〕原始實驗記錄〔4〕廢棄物處置記錄醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南〔2021版〕其它應(yīng)留意的問題還包括：消費企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：實驗樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中可以代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。實驗樣品的選擇和處置技術(shù)應(yīng)明確，以免對樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類呵斥污染和改動。實驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個消費批的加工程序和條件。用于實驗的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會影響無菌測試的有效性。醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南〔2021版〕其它應(yīng)留意