本科畢業(yè)論文-日本囊對蝦微衛(wèi)星引物的篩選與條件優(yōu)化研究_第1頁
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日本囊對蝦微衛(wèi)星引物的篩選與條件優(yōu)化研究生物工程06-2李亞菲指導(dǎo)教師:董世瑞內(nèi)容摘要:對日本囊對蝦微衛(wèi)星引物進行篩選,采用三級篩選的方法。首先利用降落PCR確定引物退火溫度的范圍,其次利用梯度PCR確定引物退火溫度,然后采用正交試驗設(shè)計方法和單因素優(yōu)化進行PCR反應(yīng)體系中Mg2+、dNTPs、引物濃度三個因素的優(yōu)化,Mg2+對擴增效果影響的顯著性最大,建立最優(yōu)的擴增體系。PCR產(chǎn)物通過8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色的方法進行檢測。量化分析結(jié)果表明,在10μl反應(yīng)體系中,Mg2+、dNTPs、引物三個參數(shù)的最適濃度分別為1.2μl25mM/LMg2+,0.8μl10dNTPs,0.8μl10SSR引物。關(guān)鍵詞:日本囊對蝦;微衛(wèi)星;PCR1導(dǎo)言1.1日本囊對蝦簡介日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)是一種前景發(fā)展較好的養(yǎng)殖品種,廣泛分布于印度、澳大利亞、紅海、坦桑尼亞、菲律賓到日本的東南沿海,我國江蘇以南沿海也有分布,現(xiàn)已成為我國南、北方重點養(yǎng)殖的主要對象。日本囊對蝦對水溫的要求介于斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)和中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)之間,日本囊對蝦生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)能力好,抗病能力也較中國對蝦、斑節(jié)對蝦等養(yǎng)殖蝦類強。1.2PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction),簡稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性→退火→延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;PCR反應(yīng)體系:1、引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1~0.5μM,這一引物濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應(yīng)體系中循環(huán)擴增30T。以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會,但濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。2、Taq酶:目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng),一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,但保真度較差,在復(fù)制比較長的模板時容易發(fā)生點突變。另一種為在大腸桿菌合成的基因工程酶。能催化以DNA單鏈為模板,以堿基互補原則為基礎(chǔ),按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端,合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性,沒有校正功能。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶用量一般為0.5~5U/100μl,濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3、dNTP:dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系。多次凍融會使dNTP降解,一般存儲濃度為10mM,小量分裝,-20℃冷凍保存。在PCR反應(yīng)中,dNTP濃度一般為50~200μM,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。高濃度dNTP可加速反應(yīng),但同時會增加錯誤摻入和實驗成本;低濃度dNTP可提高PCR的精確性,但反應(yīng)速度和PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量會降低。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+4、模板:就模板而言,影響PCR的主要指模板的數(shù)量和純度。一般PCR反應(yīng)中模板的數(shù)量為102~105個拷貝,靈敏的PCR甚至可從一個細胞、一根頭發(fā)、一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板的純度一般要求不是很高,某些擴增實驗中甚至將裂解液直接作為PCR模板。但模板中不能有影響擴增反應(yīng)的物質(zhì)存在,如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉類物質(zhì)等,上述物質(zhì)的存在會影響擴增效果,甚至使擴增失敗。模板DNA的量不能太高,否則擴增可能不會成功,在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。一般對于單拷貝的哺乳動物基因組模板來說,100ul的反應(yīng)體系中有100ng的模板已足夠。5、Mg2+:Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。一般PCR反應(yīng)中,當(dāng)dNTP濃度為200μM時,Mg2+濃度為1.5~2.0mM為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,Mg2+濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。此外,Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成等。PCR反應(yīng)條件:1、變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃/min足以使模板DNA變性,若低于2、退火溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃3、延伸溫度與時間:PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為724、循環(huán)次數(shù):循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30~40T之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR技術(shù)的反應(yīng)動力學(xué):PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行,使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加,而進入線性增長期或靜止期,即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”,這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。大多數(shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的。1.2.1標(biāo)準(zhǔn)PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴DNA聚合酶的酶促反應(yīng)利用PCR技術(shù)能夠從復(fù)雜的DNA分子群體中選擇性地復(fù)制一段特異的序列,使某一DNA片段得到特異性的擴增。特異性、有效性和忠實性是檢驗PCR擴增效率的三個指標(biāo)。研究表明,這三個參數(shù)都受到PCR反應(yīng)體系中的眾多成分(如Mg2+、dNTPs、引物、模板等)及反應(yīng)參數(shù)的影響,并且使PCR反應(yīng)獲得高度特異性、高度忠實性、高產(chǎn)量的條件并不一致,特別對于一些基因組DNA復(fù)雜的模板,普通PCR往往得不到理想的產(chǎn)物。1.2.2TouchdownPCR1991年,DonRH等[1]提出了降落(touchdown,TD)PCR技術(shù),其基本原理為:根據(jù)引物的Tm值,設(shè)置一系列從高至低的退火溫度,開始選擇的退火溫度高于估計的Tm值,隨著循環(huán)的進行,退火溫度逐漸降低至Tm值,從而確保第一個引物-模板雜交事件發(fā)生在最互補的反應(yīng)物之間,并最終低于Tm值。TDPCR廣泛的適用于有非特異性產(chǎn)物和沒有適宜退火溫度等的情況[1]。即使有適宜的退火溫度,TDPCR也能幫助避免次要的問題發(fā)生,例如,在不同的PCR儀之間,最適的退火溫度也有可能發(fā)生改變[1]。TDPCR也是一種潛在的一步法找到最佳退火溫度的方法[2],對于Tm值相近的PCR反應(yīng)可在同一循環(huán)條件下進行,大大提高了工作效率[3]。1.2.3梯度PCR梯度PCR(GradientPCR)是根據(jù)計算退火溫度計算值設(shè)定PCR循環(huán)程序中退火溫度變化范圍,通過實驗確定最佳反應(yīng)條件。梯度PCR程序設(shè)計了具有獨特的梯度升降溫功能程序,只需進行最低(第1列)、最高(第12列)溫度二點設(shè)定,能在96孔反應(yīng)基座上形成溫度梯度,中間10列溫度將根據(jù)最低、最高溫度自動進行梯度遞增(或遞減),一次可控制12個點的溫度變化。根據(jù)擴增的最終效果進行比較,確定最佳的擴增反應(yīng)條件。因此,在摸索PCR擴增條件時,只需一次或少量幾次反應(yīng)便可尋找最佳條件。梯度PCR程序設(shè)計簡單、直觀、快速,適用于各種核酸分子(RNA、DNA)的擴增,具有高效率、高通量的優(yōu)點,適用于摸索實驗條件時,多次實驗可同時在一臺儀器上完成,既節(jié)省實驗時間、提高效率,又節(jié)省實驗成本。1.3微衛(wèi)星概述微衛(wèi)星又稱作簡單序列重復(fù)(simplerepeatsequence,SSR)或者短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR),一般是指以1-6個核苷酸為重復(fù)單位的重復(fù)序列。微衛(wèi)星DNA是近年來迅速發(fā)展起來的一種DNA標(biāo)記技術(shù),其中以兩堿基重復(fù)最為常見,即(CA)n和(GT)n(n大約為10~60)。由于微衛(wèi)星序列具有高度可變的特性,所以無論在群體遺傳學(xué)還是在個體識別以及親子鑒定等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾遺傳模式,呈共顯性遺傳,因此,可以根據(jù)某個微衛(wèi)星標(biāo)記區(qū)分純合顯性個體和雜合顯性個體。根據(jù)微衛(wèi)星核心序列的側(cè)翼序列保守性進行引物設(shè)計,就可以在該物種甚至近緣物種中進行微衛(wèi)星多態(tài)性的分析。1.4微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在日本囊對蝦遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用通過建立隨機基因組文庫和序列測序,對日本囊對蝦基因組進行了較大規(guī)模的微衛(wèi)星分布特征分析。在1606711bp的隨機基因組序列中,共找到1206個微衛(wèi)星序列,其序列總長度約占測序序列總長度的5.9%。微衛(wèi)星序列中,以兩核苷酸重復(fù)的序列數(shù)目最多,約占微衛(wèi)星總數(shù)的69.82%,三核苷酸重復(fù)次之,約占12.35%。兩核苷酸重復(fù)中以AT重復(fù)最為豐富,約占兩核苷酸重復(fù)序列總數(shù)的29.44%。微衛(wèi)星在低拷貝區(qū)間(≤42)數(shù)量相對較大,約占比例為72.31%。重復(fù)單位拷貝數(shù)的變異能力分析表明,變異系數(shù)最大的前3種重復(fù)類型,均為4—6核苷酸,較長重復(fù)單位類型有著較強的變異能力。微衛(wèi)星重復(fù)單位長度與其拷貝數(shù)的相關(guān)分析表明,二者呈負相關(guān)(r=-0.428),即隨著重復(fù)單位長度的增加,其拷貝數(shù)在減少。兩核苷酸重復(fù)4種類型和三核苷酸重復(fù)10種類型基序AT含量與重復(fù)序列數(shù)目的相關(guān)分析表明,隨著重復(fù)類型基序AT含量的增加,其相應(yīng)的序列數(shù)目增多。同時,微衛(wèi)星各重復(fù)類型基序GC含量在0—70%間時,兩端側(cè)翼序列GC含量與之存在著正相關(guān)關(guān)系.這可能意味著微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列的堿基組成對微衛(wèi)星的產(chǎn)生和進化有一定的影響。Sugaga[4]同時用微衛(wèi)星和RFLP技術(shù)對Aichi、Ehime、Kumamoto和Kagoshima4個野生群體的日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)的親緣關(guān)系進行了研究,通過計算遺傳距離并繪制出系統(tǒng)聚類圖,清楚客觀地反映了4個地理群體的地理分布薺導(dǎo),遺傳分化及親緣關(guān)系,5個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的結(jié)果表明Kumamoto和Kagoshima地區(qū)的日本囊對蝦之問的親緣關(guān)系很近。當(dāng)?shù)厝后w之間在地理隔離和歷史效應(yīng)下并沒有發(fā)生空間隔離,并且認為可能是Kumamoto和Kagoshima兩群體的混合體。1.5微衛(wèi)星結(jié)果的檢測擴增的結(jié)果可以首先用瓊脂糖凝膠電泳檢測,但這種方法很難檢測出等位基因片段相差較小的產(chǎn)物之間的差別,尤其是當(dāng)微衛(wèi)星各等位基因片段間的多態(tài)性僅表現(xiàn)為幾個bp的差異時,一般都需要采用變性或非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)來檢測微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。但非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在檢測微衛(wèi)星時往往產(chǎn)生較多的非特異性帶,因而最好采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[5]。微衛(wèi)星的擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,目標(biāo)產(chǎn)物的檢測主要采取顯色法,如放射自顯影法、熒光染料標(biāo)記法、溴化乙錠(EB)法和銀染法。放射自顯影法具有靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點,但是有放射性同位素操作,而且過程比較繁瑣;熒光染料標(biāo)記法檢測靈敏度低;EB染色法方便易行,但聚丙烯酰胺對EB的熒光有猝滅作用,大大降低了溴化乙錠染色靈敏度;因此,現(xiàn)在趨向于使用銀染法來檢測擴增產(chǎn)物[6]。銀染的原理是:當(dāng)銀離子與核酸中帶負電荷的磷酸基團共價結(jié)合后,在堿性環(huán)境條件下,由甲醛還原成黑褐色的金屬銀沉積于膠中而顯示DNA帶型[7],從而使膠中核酸所在的位置顯示出顏色來。1.6研究目的及意義影響PCR反應(yīng)的因素很多,其中如何獲得高濃度和純度的DNA以及PCR反應(yīng)體系中各種成分因子的優(yōu)化組合,是獲得清晰可重復(fù)的擴增產(chǎn)物的前提,也是擴增反應(yīng)成功的關(guān)鍵[8]。利用正交試驗設(shè)計方法和單因素優(yōu)化方法,優(yōu)化PCR反應(yīng)體系dNTPs、引物、Mg2+濃度三個因素,以期獲得高質(zhì)量的擴增結(jié)果,為后續(xù)工作提供技術(shù)支持。2材料與方法2.1材料本實驗所用材料日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus),由中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所提供。2.2試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs(4種混合)、Mg2+、10×PCRbuffer均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品,PCR引物由上海生工生物工程公司合成,銀染及所需其他試劑均為國產(chǎn)。兩對微衛(wèi)星引物分別為:表1微衛(wèi)星引物序列及Tm值引物序列Tm值MPSSR036FGTTACATGCGAGTTGCTATTRAAGGGAATTAGTAGAGTCTG51MPSSR043FTGGTGGTTCGGAAGAGGTRATTGCTGTCGGGATGAGA51F:正向引物R:反向引物表2實驗藥品試劑名稱生產(chǎn)廠商冰乙酸天津市凱通化學(xué)試劑有限公司溴酚藍天津市凱通化學(xué)試劑有限公司甘氨酸天津市凱通化學(xué)試劑有限公司過硫酸銨天津市凱通化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉天津市凱通化學(xué)試劑有限公司SDS天津市凱通化學(xué)試劑有限公司氯化鈉天津市贏達稀貴化學(xué)試劑廠無水乙醇天津市贏達稀貴化學(xué)試劑廠蔗糖天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司Tris-baseSCIENTIFICRESEARCHSPESIAL公司EDTA2NaSCIENTIFICRESEARCHSPESIAL公司瓊脂糖GENETECHCOMPANYLIMITEI公司蛋白酶KAMRESCO公司酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)Solarbio公司海洋動物組織基因DNA提取試劑盒TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO,LTD公司D2000TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO,LTD公司溴化乙錠(EB)TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO,LTD公司dNTP上海生工生物工程有限公司RNaseA上海生工生物工程有限公司Taq酶上海生工生物工程有限公司RAPD隨機引物(TCCGCAACCA)上海生工生物工程有限公司各種試劑的配置方法:1、脫氧核苷三磷酸(dNTP)把每一種dNTP溶解于水至濃度各為100mmol/L左右,用微量移液器吸取0.05mol/LTris堿分別調(diào)節(jié)每一dNTP溶液的PH值至7.0(用PH試紙檢測),把中和后的每種dNTP溶液各取一份作適當(dāng)稀釋,在下表給出波長下讀取光密度,計算出每種dNTP的實際濃度,然后用水稀釋成終濃度為50mmol/L的dNTP,分裝成小份貯存于-70℃2、EDTA(0.5mol/L,PH=8.0)在800ml的水里面加入186.1gEDTA.2Na,在磁力攪拌器上劇烈攪拌,用NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值到8.0(約20gNaOH的顆粒)然后定容到1L,分裝后高壓滅菌然后使用。3、溴化乙錠(10mg/ml)在100ML的水中加入1g溴化乙錠,磁力攪拌數(shù)小時以保證其完全溶解,然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色小瓶,保存于室溫。4、MgCl2(1mol/L)在800ml的水中溶解203.3gMgCl2.6H2O。用水定容至1L,分裝成小份并且經(jīng)過高壓滅菌使用。5、NaCl(5mol/L)用800ml的水溶解292.2gNaCl加水定容至1L分裝后高壓滅菌。6、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)在900ml水中溶解100g電泳極SDS,加熱至68℃助溶,加入幾滴濃硫酸調(diào)節(jié)PH值到7.2,加水定容至1L7、Tris-cl(1mol/L)在800ml水中溶解121.1gTris堿,加入濃HCl調(diào)節(jié)PH值到所需值。PH8.0加42ml,應(yīng)使溶液冷卻至室溫后方最后調(diào)定PH值,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。盡管多種類型的電極均不能準(zhǔn)確測量Tris溶液的PH值,但仍可以向大多數(shù)廠商購買到合適的電極。Tris溶液的PH值因溫度而異,溫度每升高1℃8、無DNA酶的RNA酶將RNA酶溶解于10mmol/LTris.Cl(PH7.5)、5mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的濃度,于100℃加熱15分鐘,緩慢冷卻至室溫,分裝成小份保存于9、TE1)PH7.610mmol/LTris-HCl(PH7.6)1mmol/LEDTA(PH8.0)2)PH8.010mmol/LTris-HCl(PH8.0)1mmol/LEDTA(PH8.0)儀器所用實驗儀器見表3儀器規(guī)格生產(chǎn)廠商HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司UV-2102C/PC/PCS型分光光度計尤尼柯(上海)有限有限公司TG16-W微量高速離心機長沙湘儀離心機一起有限公司W(wǎng)D-9403C紫外儀北京市六一儀器廠DYY-4C型電泳儀北京市六一儀器廠微量移液器(5-20;20-200;100-1000微升)THERMO公司微量移液器(0.5-10微升)DRAGONMED公司JT202N電子天平上海精天儀器有限公司PCR擴增儀ICYCLER公司電冰箱Electrlux公司微波爐Galanz公司表3實驗儀器2.4方法2.4.1DNA提取酚氯仿法:1、取日本囊對蝦一尾,蒸餾水漂洗4下,移入1.5ml離心管,加入75μl裂解緩(10mMTris-Cl,100mMEDTA,pH8.0)沖液,剪細,后加入400μl裂解緩沖液(10mMTris-Cl,100mMEDTA,pH8.0),再加入25μlSDS(10%),加入4μl蛋白酶K(20mg/ml),55℃2、加入等體積酚:氯仿:異戊醇(毒,密度大)=25:24:1,反復(fù)搖勻10分鐘,12000rmp離心10分鐘。(降解蛋白質(zhì)和雜質(zhì))3、取上清液,重復(fù)上步。4、取上清液,加入1/25體積的5MNaCl,混勻,加入2倍體積的凍無水乙醇。靜置30分鐘,搖勻。5、12000rmp離心10分鐘,棄上清,70%乙醇沖洗2遍。6、棄70%乙醇,室溫干燥。7、加入100μlTE(10mMTris-Cl,0.01mMEDTA,pH7.6),充分溶解8、1%的瓊脂糖凝膠檢測模板DNA的完整性和初估濃度,用紫外分光光度儀精確定量,根據(jù)定量濃度將每個樣品DNA調(diào)整為20ng/微升。試劑盒法:1、取一尾日本囊對蝦,用蒸餾水沖洗干凈放進放有200微升GA緩沖液的離心管中,渦旋震蕩15秒。2、加入20微升蛋白酶K(20mg/ml)溶液,震蕩均勻。在56℃3、加入200微升緩沖液GB,充分顛倒混勻,70℃4、加入200微升無水乙醇,充分顛倒混勻,此時會出現(xiàn)絮狀沉淀。5、將上以步驟所得的溶液和絮狀沉淀加入到一個吸附柱CB3中,并放入收集管內(nèi),12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中。6、向吸附柱CB3中加入500微升緩沖液GD,12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中。7、向吸附柱CB3中加入700微升漂洗液PW,12000rpm離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CB3放回收集管中。8、向吸附柱CB3中加入500微升漂洗液PW,12000rpm離心30秒,倒掉廢液。9、將吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm離心2分鐘,倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘,徹底晾干吸附柱里面的漂洗液。10、將吸附柱放進一個干凈的離心管內(nèi),向吸附膜中間部位懸空滴加100微升洗脫液TE,室溫放置5分鐘,12000rpm離心2分鐘,將溶液收集到離心管中。2.4.2變性聚丙烯酰氨凝膠電泳1、沖洗玻璃板,并用無水乙醇擦拭。2、6μl親和硅烷和1500μl無水乙醇混合均勻,擦拭玻璃板。3、將梳齒和邊條固定在方形玻璃板上,緊密貼合,用夾子固定。4、制膠:丙烯酰胺25ml,AP450μl,TEMED27μl。5、將制好的膠均勻涂抹在玻璃板上,等待1h。6、將膠板固定在電泳槽兩側(cè),加電泳緩沖液。7、用針頭疏通膠孔并點樣(樣品:8μl變性Buffer和8μlPCR擴增產(chǎn)物混合液)。8、電泳3h。9、脫色:將膠板放入新配置10%冰乙酸中,輕搖20min,至膠全部脫色。10、沖洗:蒸餾水沖洗膠板2次,每次不超過3min。11、銀染:加入染色液(1L水,1.5ml37%甲醛,1.5gAgNO3的混合液),輕搖30min。12、沖洗:蒸餾水快速沖洗2次。13、顯影:將膠板快速放入顯色液(30gNaCO3,1.5ml30%甲醛,200μlNa2S2O3,1L蒸餾水,4℃14、定影:加入終止液終止反應(yīng)。15、沖洗:蒸餾水洗2次,每次2分鐘。16、干燥:室溫自然干燥,用掃描儀記錄譜帶。2.4.3引物的溶解和稀釋合成后的引物溶解前在離心機上12000rmp離心5分鐘,防止開蓋時引物粉末飄散,根據(jù)合成的OD值加入適量的去離子水配成約100pmol/μl的母液,并取部分母液稀釋成10pmol/μl備用。2.4.4引物退火溫度范圍的確定采用TouchdownPCR程序,根據(jù)Tm值51℃,溫度范圍為55表4PCR反應(yīng)體系藥品和試劑名稱用量10Buffer1μl25mM/mlMgCl20.8μl2.5mM/mldNTP0.8μl10微衛(wèi)星引物10.8μl10微衛(wèi)星引物20.8μl5u/μlTaq酶0.08μl基因組DNA2μlH2O2μl反應(yīng)程序為:(1)94℃預(yù)變性5min(2)94℃40s,55℃1min,每一循環(huán)下降0.5℃,72℃1min:循環(huán)20次(3)94℃40s,2.4.5退火溫度的確定采用溫度梯度PCR,設(shè)置5個篩選溫度(48℃表5PCR儀各行退火溫度(℃)分布列12345678溫度4848.549.15051.352.252.853反應(yīng)程序為:(1)94℃預(yù)變性5min(2)94℃40s梯度設(shè)定8個退火溫度1min:循環(huán)25次。(3)2.4.6P針對Mg2+、dNTPs、引物3種因素,選用L9(34)正交表,設(shè)計的PCR各反應(yīng)成分的因素-水平及正交試驗見表6。表6PCR正交試驗設(shè)計表NumberMg2+(25mmol/L)dNTPs(10)引物(10)30.40.860.810.491.210.8以上九個處理,按表4加樣,每個處理重復(fù)三次,共27個PCR管。反應(yīng)體系體積為10μl,除上述變化因素外,每管中還應(yīng)加入10×PCRbuffer1μl,2μg模板DNA,TaqDNAPolymerase0.08μl。反應(yīng)程序為:(1)94℃預(yù)變性5min(2)94℃40s,確定退火T1min,72℃延伸1min:循環(huán)25次(3)722.4.7單因素優(yōu)化對正交試驗的結(jié)果進行極差分析,找出影響特異性的主導(dǎo)因素,根據(jù)表7進行單因素實驗優(yōu)化。表7單因素PCR反應(yīng)體系NumberMg2+(25mmol/L)dNTPs(10)引物(10)反應(yīng)程序為:(1)94℃預(yù)變性5min(2)94℃40s,確定退火T1min,72℃延伸1min:循環(huán)25次(3)722.4.8優(yōu)化后體系擴增效果檢驗選取10尾日本囊對蝦,采用優(yōu)化后的最優(yōu)反應(yīng)體系對10個樣品基因組DNA進行微衛(wèi)星擴增,并用8%變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測。3結(jié)果與分析3.1TouchdownPCR結(jié)果及分析如圖1所示:采用同一模板,MPSSR043,MPSSR036兩引物分別做三個重復(fù)實驗,在55℃-45℃的溫度范圍內(nèi)擴增,過程中使每一循環(huán)下降0.5圖1TouchdownPCR反應(yīng)擴增結(jié)果(M:Marker;1-3:MPSSR043;4-6:MPSSR036)3.2梯度PCR結(jié)果及分析如圖2所示:根據(jù)Tm值51℃,設(shè)置48℃-53℃5個篩選溫度后,梯度PCR自動生成8個溫度梯度。MPSSR036經(jīng)梯度PCR擴增后,在48.5℃,49.1℃,50℃,51.3℃,52.2℃下均能擴增出兩條清晰的條帶,無明顯非特異性產(chǎn)物,尤其在50℃下擴增出的條帶特異性稍強,而在圖2MPSSR036梯度PCR反應(yīng)擴增結(jié)果(M:Marker;1-8溫度梯度從左至右依次為48℃,48.5℃,49.1℃,50℃,51.3℃,52.2如圖3所示:同樣根據(jù)Tm值51℃,設(shè)置48℃-53℃5個篩選溫度后,梯度PCR自動生成8個溫度梯度。MPSSR043經(jīng)梯度PCR擴增后,只在49.1℃下擴增出的條帶清晰且特異性強,在50圖3MPSSR043梯度PCR反應(yīng)擴增結(jié)果(M:Marker;1-8的溫度梯度從左至右依次為48℃,48.5℃,49.1℃,50℃,51.3℃,52.23.3PCR正交試驗與反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果及分析如圖4,1-9分別為正交試驗的9個試驗設(shè)計,每個設(shè)計重復(fù)3次。通過直觀分析法,對圖4的1-9進行打分,分數(shù)越高說明條帶越清晰。因此1-9的分數(shù)依次為5,1,1,9,8,7,2,3,4。為方便描述,用Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ分別代表各因素相應(yīng)的3個水平所得結(jié)果的總和,則Ⅰ/3,Ⅱ/3,Ⅲ/3分別為各因素相應(yīng)的三個水平所得結(jié)果的平均值。對不同因素不同水平的結(jié)果進行計算后就可得,某因素在不同水平的平均值中最大值與最小值之差即為該因素極差R,而最大值對應(yīng)的水平為該因素的最佳水平[9]。表8MPSSR036極差分析Mg2+dNTPs引物I71615Ⅱ241214Ⅲ91211I/32.335.335Ⅱ/3844.67Ⅲ/3343.67R5.671.331.33根據(jù)表8中R值的大小可知,各因素對目的條帶影響的顯著性順序為:Mg2+(5.67)>dNTPs(1.33)>引物(1.33),因此,Mg2+濃度對目的產(chǎn)物的擴增起著顯著的影響。用同樣的方法可以得到,對非特異性擴增影響最大的因素也為Mg2+濃度,所以應(yīng)對Mg2+濃度進行單因素優(yōu)化分析,而其它因素的顯著性相對較小,可以取其最佳值(見表7)。圖4MPSSR036正交試驗結(jié)果同樣1-9分別為正交試驗的9個試驗設(shè)計,每個設(shè)計重復(fù)3次。通過直觀分析法,對圖5的1-9進行打分,分數(shù)越高說明條帶越清晰。因此1-9的分數(shù)依次為1,6,2,3,5,9,4,8,7。表9MPSSR043極差分析Mg2+dNTPs引物I9818Ⅱ171916Ⅲ191811I/332.676Ⅱ/35.676.335.33Ⅲ/36.3363.67R3.663.332.33根據(jù)表9中R值的大小可知,因此,Mg2+濃度對目的產(chǎn)物的擴增起著顯著的影響。用同樣的方法可以得到,對非特異性擴增影響最大的因素也為Mg2+濃度,所以應(yīng)對Mg2+濃度進行單因素優(yōu)化分析,而其它因素的顯著性相對較小,可以取其最佳值(見表7)。圖5MPSSR043正交試驗結(jié)果3.4Mg2+濃度單因素優(yōu)化結(jié)果及分析圖6MPSSR043Mg2+濃度單因素優(yōu)化的PCR結(jié)果(M:Marker,1-3Mg2+用量依次為0.4μl,0.8μl,1.2μl)圖7MPSSR036Mg2+濃度單因素優(yōu)化的PCR結(jié)果(M:Marker,4-6Mg2+用量依次為0.4μl,0.8μl,1.2μl)如圖6、圖7所示:使用同一模板,Mg2+每一濃度做三個重復(fù)實驗,1-3為MPSSR043的擴增結(jié)果,4-6為MPSSR036的擴增結(jié)果。由圖中明顯看出隨著數(shù)字的遞增,條帶的清晰度逐漸增大。由極差分析可知,在一定范圍內(nèi),對Mg2+濃度單因素優(yōu)化時,隨著Mg2+濃度增加,擴增的目的條帶也更亮更清晰,所以認為Mg2+濃度是影響擴增結(jié)果的顯著性因素。3.5優(yōu)化后體系擴增效果的檢驗如圖8所示:對選取的10尾日本囊對蝦,采用優(yōu)化后的PCR擴增體系對其進行MPSSR036(1-10),MPSSR043(11-20)擴增,均產(chǎn)生目的基因的特異性擴增產(chǎn)物,說明采用正交試驗后的反應(yīng)體系的擴增量均有很大程度的提高,說明經(jīng)優(yōu)化后的體系較合理。圖8優(yōu)化后體系PCR擴增結(jié)果(MPSSR036擴增結(jié)果1-10,MPSSR043擴增結(jié)果11-20)4討論4.1退火溫度對PCR的影響PCR作為一種體外擴增DNA的方法,在PCR循環(huán)周期中,退火溫度是影響最大的參數(shù)。退火溫度和引物中嘌呤、嘧啶的數(shù)目有關(guān),往往是根據(jù)Tm值來確定,如引物長度在15~25個堿基之間,可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來計算Tm值。高溫變性的DNA分子復(fù)性過程的第一步是兩條DNA分子隨機碰撞形成局部雙鏈結(jié)構(gòu)。這種隨機碰撞形成的局部雙鏈?zhǔn)菚簳r和不穩(wěn)定的,如此局部雙鏈的周圍堿基不配對則會重新解離,繼續(xù)隨機碰撞。一旦遇到正確的互補區(qū),局部雙鏈結(jié)構(gòu)的兩側(cè)堿基也是配對的,局部雙鏈結(jié)構(gòu)迅速向兩側(cè)延伸,形成完整的雙鏈分子。如退火溫度過低,少數(shù)堿基形成的局部雙鏈不易解鏈,難以繼續(xù)碰撞和正確配對,故復(fù)性的特異性降低。如溫度過高,則使得引物不能復(fù)性到模板上,故不能有效地啟動DNA的合成。在Tm值允許的范圍內(nèi),選擇較高的溫度,可大大減少引物和模板的非特異結(jié)合,從而提高PCR反應(yīng)的特異性。但在我們的實驗中發(fā)現(xiàn),由于TouchdownPCR最低的退火溫度較低,而這一溫度又是循環(huán)周期最多的退火溫度,較低的退火溫度下,引物往往進行非特異性配對,造成非特異性產(chǎn)物的形成,從而造成特異性產(chǎn)物的含量往往達不到理想的結(jié)果。本實驗成功應(yīng)用了梯度PCR的方法,僅需要一套溫度程序擴增,既可完成對退火溫度的優(yōu)化又能在較短時間內(nèi)快速完成基因的擴增。梯度PCR在操作和對儀器設(shè)備上與普通PCR也沒有區(qū)別和特殊的要求,可以為基因的擴增中尋找最佳退火溫度提供了快速可靠的方法,如果與多重PCR聯(lián)合運用可同時對某些疾病多基因的擴增提供有效手段,具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。4.2體系中各因素對擴增效果的影響通過正交實驗的極差分析可知,Mg2+濃度對重復(fù)序列PCR擴增的結(jié)果影響顯著。Mg2+主要是通過改變聚合酶的活性對PCR反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響,是TaqDNA酶的激活劑,其濃度對酶的活性、PCR的特異性和擴增效果均有明顯的影響,因此確定Mg2+的最佳濃度是極為重要的。體系中Mg2+濃度過低,會顯著降低酶的活性,而Mg2+濃度過高時,又使酶催化非特異性擴增增強。此外,Mg2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物解鏈的溫度,從而影響擴增片段的產(chǎn)率。由于在PCR反應(yīng)體系中的模板DNA、dNTPs、引物中的磷酸基團均可與Mg2+結(jié)合從而降低反應(yīng)體系中的游離Mg2+的濃度,因此,一般Mg2+的加入量應(yīng)比dNTPs的總濃度高出些。引物與模板比例對PCR特異性很重要。引物濃度過低可能會無擴增帶,而濃度過高易引起錯配會出現(xiàn)非特異性擴增,產(chǎn)生模糊小片斷和引物二聚體[11],出現(xiàn)條帶彌散或拖尾現(xiàn)象[12]。TaqDNA聚合酶在PCR體系中起到催化的作用,濃度過低產(chǎn)物合成量減少,濃度過高會引起非特異性擴增,一般濃度范圍在0.25~2.5U之間[13],本實驗體系選擇5U/μl較適宜模板DNA的量和純度,是PCR擴增體系中一個重要的因素,其適宜濃度有一較大范圍,濃度太高,會相應(yīng)增加非特異性擴增產(chǎn)物,使電泳圖譜背景呈彌散狀;濃度太低,則無擴增產(chǎn)物或產(chǎn)物不穩(wěn)定[14]。dNTP是PCR反應(yīng)的原料,PCR反應(yīng)體系中的四種dNTP的濃度應(yīng)當(dāng)相等,以使錯誤摻入率降至最底。適宜濃度的dNTP對于獲得理想的PCR反應(yīng)尤為重要。dNTP的濃度過高可加快反應(yīng)速度,同時也增加了堿基錯配率和實驗成本;降低濃度可導(dǎo)致反應(yīng)速度下降,降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。同時dNTP分子中的磷酸基團能定量地與Mg2+結(jié)合[15],而Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑,所以高濃度的dNTP反而會使TaqDNA聚合酶的活性下降。模板DNA的量和純度是PCR擴增體系中一個重要的因素,高質(zhì)量DNA要求盡量保持核酸分子完整性,無明顯降解現(xiàn)象,純度高,獲取效率高,能夠達到試驗要求的濃度和數(shù)量,不同樣品間絕無交叉污染[16]。其適宜濃度有一較大范圍,濃度太高,會相應(yīng)增加非特異性擴增產(chǎn)物,使電泳圖譜背景呈彌散狀;濃度太低,則無擴增產(chǎn)物或產(chǎn)物不穩(wěn)定[15]。在微衛(wèi)星PCR擴增反應(yīng)體系中,對模板的純度要求不高,反映液中蛋白質(zhì),糖,RNA等大分子物質(zhì)影響不大,但DNA溶液中殘留的酚氯仿等有機溶劑會抑制Taq酶活性。通常小分子片斷模板DNA的PCR反應(yīng)高于大分子DNA,可以通過機械剪切和稀有限制消化酶等處理,提高PCR產(chǎn)量。本實驗體系中,基因組DNA用試劑盒提取,其純度較高,可獲得較為滿意的效果。4.3正交實驗的優(yōu)化效率正交實驗設(shè)計是研究多因素多水平的一種設(shè)計方法,它是根據(jù)正交性從全面實驗中挑選出部分有代表性的點進行實驗,這些有代表性的點具備了“均勻分散,齊整可比”的特點[17],根據(jù)結(jié)果進行極差分析或方差分析,進而得出優(yōu)化因素的最佳值或是影響因素的顯著性。相對于傳統(tǒng)的單因素梯度篩選最佳條件的方法,正交實驗法是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法。在本實驗過程中,若按全面實驗要求,須進行34=81種組合的實驗,而本實驗選用了L9(34)表的正交實驗設(shè)計方案,僅需要9次實驗即可完成優(yōu)化目的,顯然大大減少了工作量,并且將反應(yīng)結(jié)果量化后,通過極差分析,可以明確得到各因素對PCR擴增體系的具體影響程度,進一步建立起比較理想的PCR擴增體系。因此,利用正交實驗優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,具有工作量小、效率高、信息量大、數(shù)據(jù)分析簡單、高可靠性等優(yōu)點,是一種值得推廣的PCR體系優(yōu)化的方法。參考文獻:[1]DonRH,CoxPT,WainwrightBJ,etal.TouchdownPCRtocircumventspuriousprimingduringgeneamplification[J].NucleicAcidsResearch,1991,19(14):4008-4009.[2]唐恩潔,楊宗琪,趙明才,等.用人肝細胞cDNA文庫制備Dig-Fas探針[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2000,15(3):1-3.[3]KomuraJ,IkehataH,HosoiY,etal.Mappingpsoralencross-linksatthenucleotidelevelinmammaliancells:suppressionofcross-linkingattranscriptionfactor-ornucleosome-bindingsites[J].Biochemistry,2001,40(13):96-105.[4]SugagaT,lkedaM,TaniguchiN.RelatednessstructureestimatedbymicrosatellitesDNAandmitochondrialDNApolymerasechainreaction—restrictionfragmentlengthpolymorphismsanalysesinthewildpopultionofkurumaprawnPenaeusjaponicus[J].FisheriesScience,2002,68(1):793-802.[5]曲魯江,李顯耀,杜志強,張龍超,楊寧.微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物變性與非變性PAGE銀染檢測方法的比較.遺傳,2004,26(4):522-524.[6]張志峰,史洪才,武堅,簡子健.微衛(wèi)星DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染法的改良.生物技術(shù),2005,15(3):51-53.[7]MurrayV.ImproveddoublestrandedDNAsequencingusingthelinearpolymerasechainreaction.NuclAcidsRes,1989,17(21):88-89.[8]鄭敏,羅玉蘋.真核生物基

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