Kibra和aPKC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)及意義

目錄一、摘要1中文摘要 12英文摘要 4二、正文1前言 62材料與方法 83結(jié)果3.1HE染色結(jié)果 113.2Kibra結(jié)果 123.3aPKC結(jié)果 194討論 265結(jié)論 276參考文獻(xiàn) 28三、綜述1綜述 312結(jié)語 413參考文獻(xiàn) 42四、致謝 48Kibra和aPKC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)及意義中文摘要概述Kibra是一個(gè)含有WW結(jié)構(gòu)域，表達(dá)于腎臟和腦組織的蛋白質(zhì)。通過基因組單核苷酸多態(tài)性篩選證實(shí)，Kibra參與了人類記憶認(rèn)知功能。大量研究表明，Kibra表達(dá)在記憶相關(guān)的腦組織區(qū)域；在記憶提取的過程中，Kibra等位基因會(huì)發(fā)生明顯改變；Kibra與CLSTN2表達(dá)在記憶相關(guān)區(qū)域內(nèi)顳葉部位參與情節(jié)記憶的形成，與阿爾默海茨病病因有關(guān)。但是Kibra在腦組織中的表達(dá)部位以及在胚胎發(fā)育過程中Kibra表達(dá)部位和表達(dá)水平的變化與記憶形成的關(guān)系尚不明確。PKC（蛋白激酶C）作為一個(gè)蘇氨酸-絲氨酸家族蛋白，參與了機(jī)體很多的生理性和病理性過程。如：腦組織的發(fā)育、突觸的可塑性、癲癇病、腦缺血以及神經(jīng)細(xì)胞的死亡。aPKC(非典型蛋白激酶C)為蛋白激酶C家族中的一個(gè)類型，可以分為三個(gè)亞型，PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ。這些亞型在突觸可塑性和神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮了重要的作用。它們介導(dǎo)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，P70S6激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與腫瘤的發(fā)生，細(xì)胞極性的形成以及記憶的長時(shí)程增強(qiáng)。大腦記憶的主要功能區(qū)域在海馬，其次為顳葉和小腦，因?yàn)镵ibra和PKC在胚胎發(fā)育腦組織中的具體表達(dá)部位及其意義還未闡明，如果能證實(shí)它們表達(dá)于大腦這些與記憶相關(guān)的區(qū)域，能為記憶形成的機(jī)理研究打下一定基礎(chǔ)。同時(shí),最近研究發(fā)現(xiàn)，Kibra與PKC關(guān)系密切，可能是PKC磷酸化的底物。本研究以大鼠不同發(fā)育時(shí)期的腦組織（不同胚胎期、新生、成年）為研究對(duì)象,通過HE染色了解腦組織的基本結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)；陰道抽液法確定受孕日期；免疫組織化學(xué)方法檢測Kibra和aPKC在不同時(shí)期腦組織中的表達(dá)，從而探討二者在突觸可塑性和記憶形成的聯(lián)系。結(jié)果顯示：1、Kibra在大腦皮層、海馬、小腦的細(xì)胞核中表達(dá)；在10d、12d表達(dá)陰性，14d表達(dá)弱陽性，16d、18d、新生、成年大鼠陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)。2、aPKC在大腦皮層、海馬、小腦細(xì)胞的細(xì)胞連接處表達(dá)，且在各個(gè)時(shí)期腦組織均為陽性表達(dá)。目的1、掌握了解大鼠腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組織特點(diǎn)。2、研究Kibra和aPKC在不同時(shí)期的大鼠腦組織中的表達(dá)。3、初步探討Kibra和aPKC在大腦記憶形成中的相關(guān)性。方法1、將雌雄成年鼠合籠，陰道抽液確定懷孕日期（檢查到精子記為懷孕0.5天）。2、收集不同時(shí)期（胚胎第10d，12d，14d，16d，18d，20d）胚胎鼠、新生鼠及成年鼠各兩只，共16只，分別標(biāo)記、取腦組織。3、固定標(biāo)本并切片（做冰凍切片和石蠟切片二種），HE染色、同一時(shí)期的大鼠腦組織分別用ABC三步法免疫組織化學(xué)法進(jìn)行Kibra和aPKC染色。結(jié)果1、Kibra在大腦皮層、海馬、小腦的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；在胚胎10d、12d表達(dá)陰性；胚胎第14d在大腦皮層表達(dá)弱陽性，胚胎第18d在大腦皮層表達(dá)陽性，海馬區(qū)表達(dá)弱陽性；新生鼠在大腦皮層、海馬、小腦的浦肯野細(xì)胞中表達(dá)陽性。隨著胚胎的發(fā)育，表達(dá)逐漸增強(qiáng)。2、aPKC自胚胎第10d在大腦皮層、海馬、小腦細(xì)胞的細(xì)胞連接處表達(dá)陽性且均在各個(gè)腦組織時(shí)期表達(dá)陽性，隨著胚胎發(fā)育，表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢。結(jié)論1、Kibra較aPKC晚表達(dá)于腦組織中，Kibra在腦組織中的表達(dá)隨胚胎發(fā)育逐漸增強(qiáng)，表達(dá)區(qū)域逐漸擴(kuò)大。2、aPKC在自胚胎早期即表達(dá)于腦組織，說明是腦組織發(fā)育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在腦組織海馬、大腦皮層和小腦中表達(dá)，提示了二者可能存在潛在的相互作用和聯(lián)系，參與了記憶的形成。關(guān)鍵詞：記憶形成；腦組織；Kibra；aPKC;免疫組化；HE染色ExpressionandsignificanceofKibraandaPKCincentralnervoussystemduringembrynicdevelopmentCandidate:ZhouJin’anSupervisor:Prof.DuanYaqiTongjiMedicalCollege,HuazhongABSTRACTSummarizeTheKibrageneencodesacytoplasmaticprotein,amemberofthesignaltransductionproteinfamily,expressedmainlyinthebrain.RecentstudieshaveimplicatedtheinvolvementofageneticvariationintheKIBRAgene(Tallele)inhumanmemoryinnormalsubjectsandintheriskofdevelopingAlzheimer'sdisease(AD).PROTEINKINASEC(PKC)isanintegralpartinthecellsignalingmachinery.Biochemicalandmolecularcloninganalysishasrevealedthat,likemostothersignalingproteins,theenzymecomprisesalargefamilywithmultipleisoformsexhibitingindividualcharacteristicsanddistinctpatternsoftissuedistribution.Thebiologicalsignificanceofthisheterogeneityhasnotbeenfullyclarified,butthefunctionofeachPKCisoformforcellularregulationisbeinginvestigatedextensively.Presently,thepossibilitymaynotberuledoutthatsomeisoformsrepresentsimplyaredundancy,butplausibleevidencesuggeststhatthemembersofthisenzymefamilyareactivatedinspecificintracellularcompartmentsindifferentways,dependingonvariousmembranelipidmetabolites,andplaydistinctrolesforthecontrolofmajorcellularfunctions.ObjectiveTheaimofourstudywastoinvestigatethemorphologicalstructureandfeaturesoforganizationinbraintissues.TheexpressionofKibraandaPACinbraintissuesweredetectedaswell.MethodsThefemaleandmaleratswerematedanddatesofpregnantwereconfirmedbyvaginalfluid.Thebraintissuesoffetusesrats(10d,12d,14d,16d,18d,20d),neonatalratsandadultratsatdifferentstageswerecollected.Routinelyprocessed4%formamint-fixed,frozensectionsandparaffin-embeddedblockswerearchived.KibraandaPKCwerestainingbyHEandABCimmunohistochemicalmethods.ResultsKibrawasexpressedinthenucleiofcerebralcortex,hippocampusandepencephalon.TheexpressionlevelsofKibrawerenegativeonday10,12,weaklypositiveonday14.Theexpressionlevelwasgraduallyincreasedinneonatalratsandadultrats.TheexpressionofaPKCwaspositiveintheadherensjunctionsofcerebralcortex,seahorseandepencephalonatdifferentperiodofbraintissues.Conclusion1、Inbraintissues,theexpressionofKibraislaterthanaPKC.TheexpressionlevelandareaofKibraincreaseswiththeembryonicdevelopment.2、aPKCisanindispensablecomponentofbraindevelopmentbecauseitexpressesinbraintissueinearlyembryon.3.ColocalizationofKibraandaPKCinthecerebralcoretex,hippocampusandcerebellummayimplicatetheirrolesinmemoryformation.Keywords:engraphia;Kibra;aPKC;immunohistochemistry;HEstainingKibra和aPKC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)及意義前言人類記憶的形成在神經(jīng)生物界至今是一個(gè)謎。一些研究者對(duì)記憶的獲得、維持和再現(xiàn)的機(jī)制仍在尋求答案。記憶的形成是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，需要各種蛋白質(zhì)分子的相互作用參與。其中，情節(jié)記憶是人類對(duì)過去特定的時(shí)間特定經(jīng)驗(yàn)信息的一個(gè)儲(chǔ)存ADDINNE.Ref.{67EDEBCA-ECC8-4248-ABBD-1E96527FE154}[1]。情節(jié)記憶50%是由遺傳獲得ADDINNE.Ref.{AAAB2BD6-5DAD-48BE-8D2E-C08FD0C87EC6}[2]，但是個(gè)體情節(jié)記憶的遺傳差異的機(jī)制尚不清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，個(gè)體間的記憶遺傳差異歸功于記憶形成過程中記憶相關(guān)信號(hào)分子ADDINNE.Ref.{CDF4B773-BC5B-49BB-AF56-9BCD8249EBCC}[3]。在這些相互作用的分子中，Kibra是一個(gè)近期研究比較熱門的分子，通過運(yùn)用單核苷酸多態(tài)性的基因組相關(guān)研究表明，Kibra與人類情節(jié)記憶有關(guān)。最近的研究結(jié)果也一再顯示了Kibra在記憶形成過程中的重要性ADDINNE.Ref.{A0641C64-9BAC-40BA-83FF-7989D6C7EAC3}[4,5]。Kibra是一個(gè)含有WW-結(jié)構(gòu)域的蛋白分子，表達(dá)于腎臟和腦組織中ADDINNE.Ref.{5C3830BB-45C2-4C2D-8C14-EDDD61B5953C}[6]。在海馬及顳葉這些與記憶高度相關(guān)的區(qū)域高度表達(dá)ADDINNE.Ref.{9BEA9573-B6CA-46BC-9DA2-67887DD1DDEA}[7,8]。Kibra被證實(shí)涉及到情節(jié)記憶形成的過程中，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，突觸可塑性，長時(shí)程增強(qiáng)及突觸傳遞ADDINNE.Ref.{C621A9B9-D7CA-4E9C-80A2-E0B4FAAA2DDF}[6,7,9]。Kibra還通過與多種分子相互作用參與到多種生理功能中，如：信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞極性的分化、細(xì)胞的遷移、囊泡遞質(zhì)的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)ADDINNE.Ref.{75EC50C7-82F8-4E48-A273-5A1EDFF15559}[10]等。在乳腺癌MCF7細(xì)胞中Kibra還與DLC1共同激活雌激素受體ADDINNE.Ref.{A3B68FE1-2A25-4407-BD28-036BB997803D}[11]，對(duì)乳腺癌的治療、預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。PKC是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族的一個(gè)成員，通過磷酸化反應(yīng)來調(diào)節(jié)許多的細(xì)胞功能ADDINNE.Ref.{82EC5496-E1A6-440F-9ED4-EDD5C25A3994}[12]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能將PKC分為12種亞型。aPKC由于缺少Ca離子和二酰甘油結(jié)合區(qū)，故激活機(jī)制不同于其他PKC。aPKC可分為三種亞型：PKCζ、PKCλ/ι、PKM。三者的結(jié)構(gòu)如綜述圖1所示。aPKC包含調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)二個(gè)結(jié)構(gòu)域，PKCζ、PKCλ/ι在催化區(qū)有高度相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)，這二種亞型在基因敲除小鼠不同表型中發(fā)揮的作用是不同的。敲除PKCλ/ι的小鼠由于胚胎早期細(xì)胞極性的缺陷在胚胎期死亡，而敲除PKCζ的小鼠卻可以存活。說明，在胚胎發(fā)育中PKCλ/ι對(duì)細(xì)胞極性的建立至關(guān)重要，而PKCζ不參與這個(gè)過程ADDINNE.Ref.{C31D2021-AEE5-45E9-B029-796054F2E6C3}[13]。在各種細(xì)胞中，PKCζ參與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)；活性突變的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1ADDINNE.Ref.{2A1BEEEA-1A2C-44D8-83AE-DD86D1A37EFC}[14-17]；野生型PKCζ的過度表達(dá)激活ERK1和ERK2，增加EIK1的轉(zhuǎn)錄活性；參與受體信號(hào)復(fù)合物到NFκB轉(zhuǎn)錄因子的活化ADDINNE.Ref.{70FDFEA7-E569-481C-B475-2D5DD21BDD3D}[18,19]和P70S6激酶信號(hào)及級(jí)聯(lián)反應(yīng)ADDINNE.Ref.{C986ECD5-2DE7-4E55-9FBA-D6D5E2D6FA6B}[20,21]等。PKCλ/ι在一些惡性腫瘤如非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌中異常表達(dá)，持續(xù)過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞極性、粘附作用喪失，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、發(fā)展、預(yù)后有一定的關(guān)系A(chǔ)DDINNE.Ref.{A15B1049-4306-4D65-919B-72D87360307B}[22,23]。而PKM只含有催化區(qū)，是一個(gè)截短型的aPKC分子ADDINNE.Ref.{539AC6CD-3536-4725-B29A-F376F0093BA7}[24]，一旦產(chǎn)生，就始終處于激活狀態(tài)。研究表明，PKM在長期記憶的維持和海馬長時(shí)程增強(qiáng)中發(fā)揮了重要作用，是一個(gè)必不可少的分子ADDINNE.Ref.{E5A8B35E-8E3E-4E70-8112-27BA6365FC86}[25]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Kibra和aPKC在不同鼠腦組織發(fā)育過程中的表達(dá)部位，通過初步探討二者的表達(dá)，為進(jìn)一步研究二者間的相互作用提供定位依據(jù)。一些實(shí)驗(yàn)研究表明：Kibra和aPKC通過與不同分子的相互作用共同參與信號(hào)通道中，發(fā)揮相同的功能。Kibra作為aPKC磷酸化的底物這是至今唯一明確的關(guān)于二者直接相互作用的研究發(fā)現(xiàn)。如果Kibra被PKC磷酸化后參與記憶的形成，那么通過對(duì)Kibra及PKC在胚胎發(fā)育過程中定位的研究，可以部分揭開兩者神秘關(guān)系的面紗。材料和方法一材料（一）動(dòng)物成年健康250g左右SD大鼠24只：購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（二）試劑1.Kibra及aPKC抗體購于美國Santacruz公司，最終稀釋濃度：Kibra為1：200，aPKC為1:1000。2.4%多聚甲醛：稱取40g多聚甲醛,加熱至60℃左右的蒸餾水約400ml，攪拌,加入少量的1MNaOH溶液，攪拌至完全溶解（一直保持60℃的溫度）；加入0.2M的PBS500ml，冷卻后過濾，蒸餾水定容至1000ml。PH值調(diào)至7.2-7.4，放入4℃冰箱預(yù)冷，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.0.2MPBS：(1)Na2HPO4·12H2O5.67g溶于200ml蒸餾水(2)NaH2PO4·2H2O1.56g溶于50ml蒸餾水，4.免疫組化用PBS：Na2HPO4·12H2O14.4999g、NaH2PO4·2H2O1.482g、Nacl45g溶于5L蒸餾水中，調(diào)PH至7.4。5.30%蔗糖：（1）稱取14.2Na2HPO4·12H2O14.2g溶于100ml蒸餾水中，（2）稱取NaH2PO4·2H2O12g溶于100ml中，分別?。?）72.9ml和（2）27.1ml混合，加入30g蔗糖溶解其中，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.OCT包埋劑：購于美國SAKURA產(chǎn)品。7.ABC試劑：購于北京中杉金橋免疫組化專用ABC試劑盒。8.95%乙醇：950ml無水乙醇，50ml雙蒸水。9.90%乙醇：900ml無水乙醇，100ml雙蒸水。10.80%乙醇：800ml無水乙醇，200ml雙蒸水。11.抗原修復(fù)液：0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml），檸檬酸三鈉3g，檸檬酸0.4g，混勻。12.3%H2O2：30%H2O2，PBS按體積1:10比例混合13.DAB：購于美國R&DSystems公司。14.1%鹽酸酒精：75%的酒精100ml+1ml濃鹽酸（三）主要儀器HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)。二方法（一）獲取胎鼠腦組織(1)獲取胎鼠：第一天下午17:30以2:1的比例雌雄合籠，于次日9點(diǎn)前進(jìn)行陰道抽液并涂片，鏡下觀察精子，記錄陰道涂片有精子的雌鼠進(jìn)行標(biāo)記并記錄為妊娠0.5天。(2)待胎鼠孕育到所需天數(shù)后麻醉孕鼠剖腹取出胎鼠，麻醉，斷頭。冰上分離其腦組織。(3)獲取新生鼠及成年大鼠的腦組織：取新生鼠及250g成年大鼠，麻醉，剪開胸腔，暴露心臟。從心尖處將灌流針插入左心室，剪開右心耳。先灌以少量生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌流。待新生鼠四肢抽搐，僵硬，變白后，斷頭取腦，冰上分離腦組織。(4)腦組織的處理及后固定：以上腦組織分離后分別投入4%多聚甲醛過夜，后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖中。待沉底后，OCT包埋，液氮速凍一分鐘，放置-70℃冰箱保存。所有標(biāo)本收集齊后，進(jìn)行腦組織切片。(5)腦組織切片：將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，從平行大腦中線面進(jìn)行矢狀切片，片厚5μm，每5張取一張。烤片過夜，待染色。（二）HE染色步驟（1）脫蠟：二甲苯脫蠟10mins×2。（2）水化：100%酒精，95%酒精，75%酒精依次放置5mins。（3）自來水沖洗后過雙蒸水，1min。（4）蘇木素染色5min后，充分自來水沖洗1min；將玻片表面蘇木素沖凈然后過鹽酸酒精分化10s。（5）流水沖洗，觀察染色是否充分。（6）伊紅染色20秒，然后用無水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫水，2min/次。（7）吹干，中性樹膠封片。（三）免疫組化采用S-P法染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水：二甲苯10mins，二甲苯10mins，二甲苯5mins，95%酒精5mins，80%酒精5mins，75%酒精5mins，蒸餾水2mins。（2）高壓鍋抗原修復(fù)：加入枸櫞酸鈉修復(fù)液，冒氣時(shí)開始計(jì)時(shí)1分30秒。（3）3%過氧化氫室溫孵育10mins，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。（4）自來水沖洗1min。（5）PBS5mins×3。（6）加A液37℃30mins，（7）甩掉切片上的A液，滴加用血清稀釋好的一抗，4℃過夜。（8）自來水洗1mins。（9）PBS5mins×3。（10）加B液，37℃20mins。（11）自來水洗1mins。（12）PBS5mins×3。（13）加C液，37℃20mins。（14）自來水洗1mins。（15）PBS5mins×3。（16）滴加二抗，37℃30mins。（17）自來水洗1mins。（18）蘇木素復(fù)染，透明，封片。（四）結(jié)果的閱讀和分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果由一名經(jīng)驗(yàn)豐富的技師指導(dǎo)染色，經(jīng)過二名同濟(jì)醫(yī)院副高以上專家閱片，采用HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)獲取圖片，結(jié)果真實(shí)可靠。結(jié)果一、HE染色：腦組織的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。圖1-1成年鼠腦組織HE染色（20×）圖1-2成年鼠腦組織HE染色(海馬400×)圖1-3成年鼠腦組織HE染色(小腦400×)二、Kibra結(jié)果Kibra自胚胎第14天在大腦皮層表達(dá)弱陽性；胚胎第18天在大腦皮層表達(dá)陽性，海馬區(qū)表達(dá)弱陽性；新生鼠在大腦皮層、海馬、小腦的浦肯野細(xì)胞中表達(dá)陽性。1、在大鼠胚胎發(fā)育的第10d，其腦組織為神經(jīng)管，Kibra染色結(jié)果為陰性（見圖2-1）。圖2-110d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示Kibra的表達(dá)（20×）；2、在大鼠胚胎發(fā)育的第12d，腦組織Kibra染色結(jié)果為陰性（見圖2-2）。圖2-212d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示Kibra的表達(dá)（20×）；3、在大鼠胚胎發(fā)育的第14d，大腦皮層Kibra染色結(jié)果為陽性（見圖2-3箭頭所指處）。4、在大鼠胚胎發(fā)育的第16d，大腦皮層Kibra染色結(jié)果為陽性，著色較第14d稍深（見圖2-4箭頭所指處）。5、在大鼠胚胎發(fā)育的第18d，大腦皮層Kibra染色結(jié)果為陽性，海馬區(qū)Kibra染色結(jié)果為陽性（見圖2-5箭頭所指處）。6、新生鼠免疫組化結(jié)果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達(dá)均為陽性（見圖2-6、圖2-11，圖2-6箭頭所指處從左到右分別為小腦、海馬、大腦皮層；圖2-11示新生鼠小腦）。7、成年鼠免疫組化結(jié)果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達(dá)均為陽性，并且著色較前都有明顯加深（見圖2-7、2-8、2-9、2-10）。圖2-314d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示Kibra的表達(dá)（20×）；圖2-416d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示Kibra的表達(dá)（20×）；圖2-518d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示Kibra的表達(dá)（20×）；（左側(cè)箭頭示大腦皮層，右側(cè)箭頭示海馬區(qū)）圖2-6新生鼠免疫組化結(jié)果示Kibra在大腦皮層、海馬、小腦中的表達(dá)（20×）；圖2-7成年鼠免疫組化結(jié)果示Kibra在大腦皮層、海馬中的表達(dá)（20×）；AA圖2-8圖2-7中A部分示Kibra在大腦皮層表達(dá)陽性（100×）BB圖2-9圖2-7中B部分示Kibra在海馬及齒狀回表達(dá)陽性（100×）C字形為CA區(qū)，W形為齒狀回區(qū)CC圖2-10圖2-7中C部分示Kibra在海馬區(qū)表達(dá)陽性（400×）DD圖2-11圖2-7中D部分Kibra在小腦浦肯野表達(dá)陽性（100×）三、aPKC結(jié)果：1、aPKC在細(xì)胞與細(xì)胞連接處出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。aPKC在大腦皮層，海馬，小腦中表達(dá)陽性。2、aPKC在在10d、12d、14d、16d、18d、20d、新生、成年表達(dá)均陽性（見圖3-1、圖3-2、圖3-3、圖3-4、圖3-5、圖3-6、圖3-7、圖3-8、圖3-9、圖3-10、圖3-11、圖3-12），強(qiáng)度隨生長發(fā)育的過程有逐漸增強(qiáng)的趨勢。圖3-110d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-212d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-314d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-415d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-516d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-618d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-720d胎鼠腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-8新生鼠（左）和成年鼠（右）腦組織免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（20×）；圖3-9圖3-8中E部分免疫組化結(jié)果示aPKC在海馬的表達(dá)（100×）；圖3-10圖3-8中F部分免疫組化結(jié)果示海馬區(qū)aPKC的表達(dá)（400×）；圖3-11圖3-8中G部分免疫組化結(jié)果示aPKC的表達(dá)（400×）（注：周邊一圈棕染細(xì)胞為浦肯野細(xì)胞）圖3-12圖3-8中H部分免疫組化結(jié)果示aPKC在大腦皮質(zhì)的表達(dá)（100×）；討論記憶的形成是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，大腦記憶主要部位已經(jīng)被證實(shí)為海馬區(qū)，其次為大腦皮層和小腦，這些部位蛋白的表達(dá)與記憶必定存在一定聯(lián)系。Kibra在人類腎臟和腦組織中高度表達(dá)。它第一個(gè)被證實(shí)與記憶行為有著直接聯(lián)系的支架蛋白。與記憶相關(guān)基因篩選表明，Kibra基因第九個(gè)內(nèi)含子上的單核苷酸多態(tài)性與情節(jié)記憶有關(guān)ADDINNE.Ref.{B31C2105-CBDD-4375-8341-09D5271F7CE4}[26]。Kibra蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，含有二個(gè)與富含脯氨酸靶分子結(jié)合的WW結(jié)構(gòu)域，一個(gè)感應(yīng)Ca離子的類似C2區(qū)ADDINNE.Ref.{001F596E-5B44-44FE-A4CB-BEA7E5D479B9}[27]及位于羧基端富含谷氨酸的區(qū)域ADDINNE.Ref.{9AB42464-2A24-4F67-928A-7E648E1879FB}[28]。本實(shí)驗(yàn)顯示kibra在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，特別是核周表達(dá)豐富，它在細(xì)胞質(zhì)的定位說明kibra不參與RNA剪切及轉(zhuǎn)錄等一系列細(xì)胞核蛋白的功能中。免疫組化結(jié)果表明kibra在記憶相關(guān)區(qū)域海馬CA1，CA2，CA3，齒狀回，大腦皮層，小腦，下丘腦高度表達(dá)，參與了記憶的形成。為一些神經(jīng)代謝紊亂疾病和阿爾默海茨病提供了病因依據(jù)。aPKC分為三種亞型PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ，大量研究表明PKMζ參與了長時(shí)程增強(qiáng)和長時(shí)程抑制過程ADDINNE.Ref.{14FB3CED-94FA-40D2-9476-3CF18AACE495}[29]，毋庸置疑的是這三者均為記憶認(rèn)知形成過程中的重要分子ADDINNE.Ref.{51E066FE-1F66-450F-9DF7-5F50B314CEE5}[30]。PKCλ/ι在胚胎細(xì)胞極性形成過程中發(fā)揮了重要作用，胚胎發(fā)育時(shí)PKCλ/ι表達(dá)缺陷可導(dǎo)致胚胎的死亡ADDINNE.Ref.{EC112508-7061-44C4-91EF-E371C899EE0C}[31]。PKCζ參與多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞極性的建立中ADDINNE.Ref.{25196937-68D5-48E3-BB8C-66DD79C47669}[32]。本試驗(yàn)中，aPKC在海馬，大腦皮質(zhì)，小腦這些部位表達(dá)顯著，在一定程度上與胚胎神經(jīng)發(fā)育、記憶形成有關(guān)。aPKC在Dishevelled分子作用下促進(jìn)軸突的分化，在神經(jīng)發(fā)育中有著關(guān)鍵的作用ADDINNE.Ref.{BD41064A-3144-467B-8DDA-5C106C7E6CA1}[33]。在亞細(xì)胞水平，aPKC在細(xì)胞聯(lián)合部位表達(dá)陽性，顯示aPKC在細(xì)胞極性建立中的重要性。但是aPKC在各種功能中形成復(fù)合物后下游調(diào)控的目的分子和調(diào)控這些分子后產(chǎn)生的詳細(xì)機(jī)制和功能，以及細(xì)胞極性維持和建立的分子機(jī)制、在記憶形成過程的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討。有研究報(bào)導(dǎo)，Kibra和aPKC通過與不同分子的相互作用共同參與信號(hào)通道中，發(fā)揮相同的功能。Kibra作為aPKC磷酸化的底物這是至今唯一明確的關(guān)于二者直接相互作用的研究發(fā)現(xiàn)。本研究中，在小鼠胚胎發(fā)育到14天后，Kibra在大腦皮層開始表達(dá)，而后隨著胚胎的發(fā)育逐漸表達(dá)增強(qiáng)，區(qū)域逐步擴(kuò)展到海馬、小腦。自Kibra完全表達(dá)后，其和aPKC在腦組織中表達(dá)的部位均為大腦皮層、海馬、小腦這三個(gè)與記憶明確相關(guān)的區(qū)域。Kibra在14d后開始表達(dá)至成年表達(dá)逐漸增強(qiáng)，可能說明腦組織發(fā)育到一定階段，通過Kibra的出現(xiàn)，在一系列分子機(jī)制下激活aPKC，處于激活狀態(tài)的aPKC作用于Kibra，使14d后的腦組織Kibra的表達(dá)呈現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的陽性表達(dá)。aPKC自胚胎發(fā)育的第10天即廣泛表達(dá)于腦組織中，說明其是腦組織生長發(fā)育和記憶形成中不可缺少的分子。由此，經(jīng)過我們初步探討這二者在腦組織中的表達(dá)部位，為進(jìn)一步研究它們的相互作用機(jī)制提供了一個(gè)出發(fā)點(diǎn)。結(jié)論1、Kibra較aPKC晚表達(dá)于腦組織中，Kibra在腦組織中的表達(dá)隨胚胎發(fā)育逐漸增強(qiáng)，表達(dá)區(qū)域逐漸擴(kuò)大。2、aPKC在自胚胎早期即表達(dá)于腦組織，說明是腦組織發(fā)育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在腦組織海馬、大腦皮層和小腦中表達(dá)，提示了二者可能存在潛在的相互作用和聯(lián)系，參與了記憶的形成。參考文獻(xiàn)Tulving,E.,Episodicmemory:frommindtobrain.AnnuRevPsychol,2002.53:p.1-25.Bouchard,T.J.andM.McGue,Geneticandenvironmentalinfluencesonhumanpsychologicaldifferences.JNeurobiol,2003.54(1):p.4-45.Neuropsychiatry,2009.14(4-5):p.356-76.Nacmias,B.,etal.,KIBRAgenevariantsareassociatedwithepisodicmemoryperformanceinsubjectivememorycomplaints.NeurosciLett,2008.436(2):p.145-7.Almeida,O.P.,etal.,KIBRAgeneticpolymorphisminfluencesepisodicmemoryinlaterlife,butdoesnotincreasetheriskofmildcognitiveimpairment.JCellMolMed,2008.12(5A):p.1672-6.Kremerskothen,J.,etal.,CharacterizationofKIBRA,anovelWWdomain-containingprotein.BiochemBiophysResCommun,2003.300(4):p.862-7.Johannsen,S.,etal.,Temporal-spatialexpressionandnovelbiochemicalpropertiesofthememory-relatedproteinKIBRA.Neuroscience,2008.155(4):p.1165-73.Papassotiropoulos,A.,etal.,CommonKibraallelesareassociatedwithhuman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shí)記憶。三記憶產(chǎn)生的部位目前普遍認(rèn)為海馬是記憶產(chǎn)生的部位，并把海馬作為揭示學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知過程的細(xì)胞分子基礎(chǔ)ADDINNE.Ref.{BA329D5A-3094-4723-8DAA-114B3E8F039C}[2]。海馬，是被稱作“海馬區(qū)”（hippocampalregion）的大腦邊緣系統(tǒng)的一部分。海馬區(qū)可分為：齒狀回（dentategyrus）、海馬、下托（subiculum）、前下托（presubiculum）、傍下托（parasubiculum）、內(nèi)嗅皮質(zhì)（entorhinalcortex）。人有兩個(gè)海馬，分別位于左右腦半球，它是組成\o"大腦"大腦\o"邊緣系統(tǒng)"邊緣系統(tǒng)的一部分。海馬的重要作用是將經(jīng)歷的事件形成新的\o"記憶"記憶（\o"情景記憶"情景記憶或\o"自傳性記憶"自傳性記憶）。一些研究學(xué)者認(rèn)為應(yīng)該將海馬看作對(duì)一般的\o"陳述性記憶"陳述性記憶起作用\o"內(nèi)側(cè)顳葉"內(nèi)側(cè)顳葉記憶系統(tǒng)的一部分（陳述性記憶指的是那些可以被明確的描述的記憶，比如“今天午飯吃了什么”這樣的關(guān)于經(jīng)歷過的事情的\o"情景記憶"情景記憶，以及“雞蛋是圓的”這樣的關(guān)于知識(shí)的\o"概念記憶"概念記憶）。海馬的損傷通常造成難以組織新的記憶（\o"順行性失憶癥"順行性失憶癥），而且造成難以搜索過去的記憶（\o"逆行性失憶癥"逆行性失憶癥）。另外，海馬特定部位的損傷也是癲癇及阿爾默海茨病發(fā)病的基礎(chǔ)。除海馬外，間腦，前額皮質(zhì)，小腦在記憶認(rèn)知中發(fā)揮了重要作用。四Kibra的結(jié)構(gòu)及功能Kibra是由于表達(dá)在腎臟（kidney）和腦組織（brain）而命名的。分子大小為125KD。Kibra的結(jié)構(gòu)如圖1ADDINNE.Ref.{93760AEB-BDFB-406A-B49A-5BEECF548487}[3]，人類的Kibra，由WWC1基因編碼，位于5q35.1染色體上，含有1113個(gè)氨基酸ADDINNE.Ref.{DBC1203D-20D4-4BA1-988D-34A2C886BC77}[3]。圖1從N到C端依次為2個(gè)WW位點(diǎn)（下文稱W區(qū)），C2-like（下文稱C區(qū)）區(qū)及富含谷氨酸區(qū)（下文稱G區(qū)）。W區(qū)有2條長35-40個(gè)氨基酸序列。這個(gè)氨基酸序列中包含2個(gè)保守絲氨酸殘基，這2個(gè)殘基與富含脯氨基酸序列（PPxY）的蛋白質(zhì)結(jié)合ADDINNE.Ref.{E5DE344B-FDEE-49FB-B8A1-4EA19D996C4C}[4]。C區(qū)由第655-783個(gè)氨基酸組成，這個(gè)有130個(gè)氨基酸的C區(qū)既是一個(gè)靈敏的Ca離子感受器，又參與依靠Ca離子的磷酸化過程。含有C區(qū)的蛋白質(zhì)可以感受Ca離子的濃度，進(jìn)行信號(hào)傳遞，從而促進(jìn)遞質(zhì)的釋放ADDINNE.Ref.{1C8BF066-5A1C-4F9D-927C-D04E5EBE401B}[5]，Ca離子濃度升高后，誘導(dǎo)靜息電位的變化，從而加強(qiáng)了磷酸化反應(yīng)。G區(qū)位于845-873個(gè)氨基酸之間ADDINNE.Ref.{35FE585C-8156-41AA-A244-FE84BDF58330}[3]。Kibra通過與多種分子相互作用相互反應(yīng)參與到一系列的細(xì)胞活動(dòng)中，比如細(xì)胞極性的分化、細(xì)胞的遷移、囊泡遞質(zhì)的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)及突觸可塑性。目前發(fā)現(xiàn)與Kibra相互作用的蛋白共有10種（圖2ADDINNE.Ref.{F064D782-D778-4ED9-9223-D4860D5ECCEF}[6]），通過與各種蛋白的相互作用，充分顯示了Kibra的各種功能。圖21、突觸后蛋白素（KIAA0749）ADDINNE.Ref.{A3FF0CB3-2E4B-4426-BC83-AD9E999F8E1C}[3]，它是一種樹突蛋白，在大鼠腦組織中，它的表達(dá)隨著睡眠剝奪而改變，它是從位于樹突上的mRNA翻譯而來的ADDINNE.Ref.{6569F62A-C236-4146-A103-2E7782A122E0}[7]。而且它還與α-actin，突觸骨架分子S-CAM相互作用ADDINNE.Ref.{DAAB2804-0862-4D03-B2E7-C0F641CE8487}[8]。2、synaptopodinADDINNE.Ref.{ADE2C1B5-28EB-4287-84E8-99B5140BD001}[9]及PKC，Kibra通過與他們相互作用，從而成為突出后密集區(qū)（PostSynapticDensityPSD）的一員。Synaptopodin通過KibraWW位點(diǎn)與富含脯氨酸基序（PPxY）結(jié)合。synaptopodin及PKC都位于樹突上ADDINNE.Ref.{12E882E4-3E16-43C9-B185-EA3B39C7944A}[11,12]，在組織細(xì)胞骨架中扮演了重要的角色。在synaptopodin敲除的小鼠，表現(xiàn)出長期突觸受損及缺乏樹突棘器ADDINNE.Ref.{C1B60C56-2444-4A73-B676-C45E5B2136DA}[13]。3、KIAA0513，它與認(rèn)知有一個(gè)潛在的關(guān)系，而且在精神分裂的患者KIAA0513表達(dá)上調(diào)，但它在細(xì)胞中的功能尚未明了ADDINNE.Ref.{D933F50D-CA9B-47DB-8262-9A591A4EE39C}[14]。Kibra與它的關(guān)聯(lián)說明了Kibra可能是認(rèn)知障礙疾病的一個(gè)病因，為這些疾病的治療提供了一個(gè)可能途徑。4、PATJ，PATJ是由多種保守蛋白組成的復(fù)合體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和足細(xì)胞的極性中發(fā)揮了重要作用ADDINNE.Ref.{3B5FACE1-8A82-4CC2-92D5-4CDFB46C395B}[9]。PATJ與KibraⅢ級(jí)PDZ序列結(jié)合，一起參與細(xì)胞極性的分化，而且，在上皮細(xì)胞遷移中，PATJ還調(diào)節(jié)aPKC和Par3在亞細(xì)胞水平的定位ADDINNE.Ref.{A6BD65D7-D513-4D02-AFF9-8EA6A9D715BB}[15,16]?？傊?，這些都說明Kibra和PATJ在其極性和遷移中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。Kibra被證實(shí)是突觸后結(jié)構(gòu)中的一員，以及與細(xì)胞極性蛋白的相互作用，參與細(xì)胞遷移這些充分表明了Kibra對(duì)細(xì)胞骨架的重新組裝中起到了一個(gè)中心角色的作用。5、動(dòng)力蛋白復(fù)合體ADDINNE.Ref.{C1EACD9A-EAA5-4FCE-9588-43C100A90434}[17]，有研究發(fā)現(xiàn)SNX4與復(fù)合體（復(fù)合體由微管動(dòng)力蛋白和Kibra組成）抑制鐵蛋白受體的降減從而使鐵蛋白重復(fù)利用。SNX4與復(fù)合體的下調(diào)增強(qiáng)了溶酶體介導(dǎo)的鐵蛋白受體的降減。6、sec3，sec3是exocyst復(fù)合物的一個(gè)成員ADDINNE.Ref.{AE944DEE-E4A6-42F4-B9B0-95B96239DCA2}[18]。Kibra通過聯(lián)合sec3來實(shí)現(xiàn)參與囊泡運(yùn)輸?shù)倪^程。7、Kibra/exocyst復(fù)合物通過與細(xì)胞內(nèi)靶基因PKC發(fā)生關(guān)聯(lián)，對(duì)細(xì)胞遷移中定位信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。8、組蛋白H3及動(dòng)力蛋白輕鏈1（DLC1）ADDINNE.Ref.{1D4DE26F-810F-44EF-82CD-F0F66BF45257}[4]，Kibra與動(dòng)力蛋白的相互作用還可以通過Kibra與組蛋白H3及動(dòng)力蛋白輕鏈1（DLC1）結(jié)合來得到證實(shí)。它們與Kibra的結(jié)合位點(diǎn)位于羧基端富含谷氨酸序列。在乳腺癌細(xì)胞中，去除Kibra與組蛋白結(jié)合區(qū)抑制雌激素受體α的反式激活。9、DDR1ADDINNE.Ref.{65DD2CB7-68F7-4F52-A156-42C3ACAC66E1}[19]，Kibra還與絡(luò)氨酸激酶受體（DDR1）結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。五PKC的結(jié)構(gòu)蛋白激酶C（PKC）是一個(gè)含有多種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、存活、增殖等方面發(fā)揮了重要作用，是細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵組成部分。PKC家族根據(jù)其結(jié)構(gòu)和激活方式的不同分為3種類型ADDINNE.Ref.{672AA399-2EC1-42CB-BFAF-980AF00C6E01}[20]：經(jīng)典型PKC（classicalPKC、cPKC）其下的亞型有α，βⅠ，βⅡ，γ；新型PKC（novelPKC、nPKC），它的亞型有δ、ε、η、θ；以及非典型PKC（atypicalPKC、aPKC）包含有ζ、λ/ι、PKMζ三種亞型。同時(shí)依據(jù)是否對(duì)存在Ca2+依賴，分為Ca2+依賴亞型：PKCα和PKCβII以及Ca2+非依賴亞型：PKCδ和PKCε。它們的結(jié)構(gòu)如圖3ADDINNE.Ref.{EEACF676-090C-4534-8ED3-2AD015551A93}[21]。圖3這三種蛋白激酶cPKC、nPKC、aPKCC端都有一個(gè)相對(duì)保守的激酶結(jié)構(gòu)域，N端有一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，根據(jù)調(diào)節(jié)區(qū)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同把蛋白激酶歸為不同的類型。cPKC有一個(gè)磷脂結(jié)合區(qū)和Ca離子結(jié)合區(qū)及富含半胱氨酸的二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，因此cPKC可以被二酰甘油（DAG）（磷脂酶C即PLC通過膜磷脂產(chǎn)生三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇IP3及DAGADDINNE.Ref.{C2FED616-C80F-406F-A9C7-64D87CEF9027}[20]）和Ca離子激活；nPKC不含Ca離子結(jié)合區(qū)，故對(duì)Ca離子不敏感，與cPKC相似的是它們都可以被佛波酯激活A(yù)DDINNE.Ref.{D63AC718-A673-43F7-A1C4-1CD23127C21D}[22]，原因在于它們調(diào)節(jié)區(qū)有雙鋅指結(jié)構(gòu)域的存在ADDINNE.Ref.{15EB8CD6-DDB3-4CD8-97A7-E166A52DC63C}[23]。與前二者相反的是，aPKC由于缺乏Ca離子結(jié)合區(qū)，也只有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，所以它對(duì)Ca離子和佛波酯都不敏感。除此之外，aPKC還含有一個(gè)假底物結(jié)合區(qū)域（PB1），該區(qū)可以識(shí)別其他蛋白質(zhì)的OPCA模體。在aPKC未激活狀態(tài)下，PB1與自身激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合。六PKC的激活機(jī)制PKC的激活機(jī)制是通過兩個(gè)過程完成的，即PS從底物結(jié)合位置脫落和激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化ADDINNE.Ref.{2EACF9C7-3A5C-4E71-BA73-4A10A60D7A8A}[24]。1、在PS從底物位點(diǎn)脫落過程中一些脂類發(fā)揮了重要作用。這些脂類代謝產(chǎn)物如二酰甘油，導(dǎo)致PS從激活位點(diǎn)脫落，PKC處于活化狀態(tài)。從而使其它蛋白結(jié)合到底物結(jié)合區(qū)，繼而發(fā)生磷酸化。PKCζ還可以被另一些脂類激活，如磷脂酰肌醇類ADDINNE.Ref.{961AB426-37B9-4E6D-BEED-57698CE1036D}[25]、磷脂酸ADDINNE.Ref.{4ACC38AE-17D3-4B36-9C7F-66439F2435ED}[26]、花生四烯酸以及神經(jīng)酰胺ADDINNE.Ref.{ADCAEF67-1862-4719-A6FA-6D58F6FF4B4B}[27]。在這些脂類中，PIP3（三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇）是調(diào)節(jié)PKCζ的中心環(huán)節(jié)。NaKanishi研究發(fā)現(xiàn)PIP3的合成刺激PKCζ的自我磷酸化，PKCζ的磷酸化是aPKC活化的所必需的。進(jìn)一步說明aPKC同時(shí)也受PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）的調(diào)節(jié)，因?yàn)樵谏L因子介導(dǎo)下，PI3K通過磷脂酰肌醇4、5-二磷酸產(chǎn)生PIP3ADDINNE.Ref.{7AC0D4BD-A69D-4512-9015-0AB317FCB100}[25]。另外，在大鼠的3Y1細(xì)胞，在表皮生長因子、血小板來源的生長因子刺激下，誘導(dǎo)P110（P110為PI3K的催化亞基）的過度表達(dá)，可以增強(qiáng)PKCλ/ι的活性ADDINNE.Ref.{A9585C70-7340-42E7-8D46-AAE79EB38341}[28]。在活細(xì)胞里，如脂細(xì)胞、單核細(xì)胞，PKCζ和PKCλ/ι的活性也受PI3K的調(diào)節(jié)ADDINNE.Ref.{A046FE02-C150-44F7-8633-9CBCDED421C0}[29]。PIP3與aPKC的相互作用：PIP3直接與含有PH（普列克底物蛋白同源物）的結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)合，如：PKB、PDK1。其中PDK1的PH結(jié)構(gòu)域與PIP3有更高的親和力ADDINNE.Ref.{A4637851-6C82-4435-8FBF-12125F98DB56}[30]。PDK1與PIP3結(jié)合后被激活，粘附在AGC激酶（包括蛋白激酶A、C、G）的疏水區(qū)，以至于在每個(gè)激活回路上的蘇氨酸殘基被磷酸化ADDINNE.Ref.{87C6D509-5AB1-492C-8B3C-B63712CEDE1E}[31]。aPKC疏水區(qū)包括一小段序列，苯丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸，這段小序列與PDK1和PKC相關(guān)蛋白激酶連接位點(diǎn)相似ADDINNE.Ref.{9C0E8E84-2780-48F3-AFBB-C633856C4A4F}[32]，在PKCζ的激活回路上，蘇氨酸-410位點(diǎn)被PDK1磷酸化ADDINNE.Ref.{636682DA-C57D-4570-997F-9390B1678320}[33]。在胚胎干細(xì)胞基因水平上使PDK1缺乏，PKCζ的蘇氨酸-410并沒有被磷酸化，顯著的說明PKCζ是PDK1的生理性底物。若PKCζ的蘇氨酸-410突變成丙氨酸，則失去酶活性，若突變成谷氨酸，模仿蘇氨酸被磷酸化，使酶保持活性ADDINNE.Ref.{40F6E10E-DF5F-44C1-B5D5-ABE2CE717FB5}[34]，這些表明蘇氨酸-410磷酸化對(duì)維持PKCζ的活性是至關(guān)重要的。所以，PIP3作用于PKCζ的活化有2種方式：1、對(duì)PS存在的自我抑制的調(diào)節(jié)；2、通過PDK1磷酸化激酶位點(diǎn)的間接調(diào)節(jié)，這二種方式對(duì)活化PKCζ都是必須的。2、激酶位點(diǎn)的磷酸化：蘇氨酸-560是PKCζ活化開關(guān)基序的一個(gè)關(guān)鍵殘基。研究證明，PKCζ的蘇氨酸-410突變后PKCζ可以進(jìn)行自我磷酸化，而蘇氨酸-560突變后不能進(jìn)行自我磷酸化，說明蘇氨酸-560是PKCζ進(jìn)行自我磷酸化的唯一位點(diǎn)ADDINNE.Ref.{D17A7DC3-0DF7-4F6A-B3E1-1408E922AF53}[35]。具體PKCζ的蘇氨酸-560是自己自我調(diào)節(jié)進(jìn)行磷酸化還是與其他蛋白分子相互作用進(jìn)行的磷酸化尚不明了。七aPKC的功能1、參與分裂原活化的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（MAPK）一些研究表明，在各種細(xì)胞中，PKCζ參與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)ADDINNE.Ref.{35830F80-A163-4AEC-9A6D-38B2937F5300}[36-39]。在被腫瘤壞死因子及血清刺激過的猴COS細(xì)胞，一個(gè)活性突變的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1（細(xì)胞外相關(guān)酶），但是PKCζ-kn突變型不會(huì)產(chǎn)生上述結(jié)果。在甲狀腺細(xì)胞，野生型PKCζ的過度表達(dá)激活ERK1和ERK2，增加EIK1的轉(zhuǎn)錄活性，EIK1是ERK1和ERK2的靶分子，而甲狀腺刺激素不會(huì)發(fā)揮這種效應(yīng)。在人肺泡巨噬細(xì)胞，脂多糖激活MEK1、ERK1和ERK2但不激活Raf1，在這個(gè)基礎(chǔ)上，內(nèi)源性PKCζ被激活從而與MEK1發(fā)生聯(lián)系。PKCζ-PS多肽抑制PKCζ阻斷脂多糖的效應(yīng)，這些說明PKCζ的功能主要是作為MEK1的激酶，但是在Raf1通道中是獨(dú)立的。另外，PKCζ在MEK5-ERK5通路中發(fā)揮了一個(gè)連接器的功能。它連接EGF和MEK5結(jié)合，從而增加MEK5的活性。2、參與受體信號(hào)復(fù)合物到NFκB轉(zhuǎn)錄因子的活化從細(xì)胞生長及存活的信號(hào)中，細(xì)胞外配體如TNF-α、IL-1、NGF，來自受體復(fù)合物的信號(hào)通道的調(diào)節(jié)到轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的目的基因的表達(dá)如NFκB，NFκB對(duì)這些因子起到了非常重要的作用。NFκB在細(xì)胞的生存和分化中起到了關(guān)鍵性的作用，特別是在細(xì)胞免疫和炎癥方面ADDINNE.Ref.{A021C8D0-80C8-42A9-AA20-437D1FB03F10}[40]。PKCζ-kn阻止NFκB對(duì)這些因子的刺激，顯示PKCζ在TNF-α、IL-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中參與NFκB的活化ADDINNE.Ref.{6B44A02D-7BAF-45BB-AD19-974F101404ED}[41,42]。而PKCζ對(duì)這些因子的相互機(jī)制是通過ZIP/P62來實(shí)現(xiàn)的ADDINNE.Ref.{EE83B046-D76A-427F-90DC-2B60BFA463E1}[43]，ZIP/P62作為一個(gè)連接器將PKCζ連接到這些因子受體復(fù)合物表面，從而讓這些因子發(fā)揮它們的相應(yīng)的作用。PKCζ還可以通過構(gòu)象改變導(dǎo)致NFκB的活化。另外，Par4（凋亡前體蛋白前列腺雄激素敏感因子-4）作為一個(gè)可以結(jié)合aPKC所有亞型的分子，抑制aPKC的活性ADDINNE.Ref.{3AD18E77-7E8F-48FC-BB1C-24FAD3B883CB}[44]。研究表明，Par4參與到細(xì)胞凋亡中ADDINNE.Ref.{B75E30B8-8DC6-48BE-BEDE-903953917AFC}[45]，而且，Par4的過度表達(dá)抑制NFκB的激活從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡ADDINNE.Ref.{3814C1AD-82C4-4EA0-873C-3124D3A991EA}[46]，由此可見，Par-4/PKCz/NF-kB軸是控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素?？傊?，aPKC把信號(hào)從TNF-a受體，IL-1，NGF轉(zhuǎn)到NFκB的激活位點(diǎn)，它們參與到一系列的信號(hào)通道中，從受體復(fù)合物到轉(zhuǎn)錄因子激活后目的基因的表達(dá)ADDINNE.Ref.{2FF8C137-2A7B-441A-AA80-A41B14C8EDB5}[47]。3、P70S6激酶信號(hào)及級(jí)聯(lián)反應(yīng)P70核糖體S6蛋白激酶（P70S6K），在有絲分裂素作用下被磷酸化和激活。對(duì)編碼核糖體蛋白和翻譯延長因子的一整套mRNAs的翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明，PKCλ/ι與P70S6K有直接的關(guān)系，在活細(xì)胞，PKCλ/ι的顯性失活抑制P70S6K血清誘導(dǎo)的活性ADDINNE.Ref.{26BB7000-4874-4F26-B318-EC286427E708}[48]。PKCζ-kn拮抗由EGF、PDK1、PI3K對(duì)P70S6K的激活。在生長因子不存在的情況下，體內(nèi)P70S6K與PDK1、PKCζ有關(guān)聯(lián)，P70S6K是AGC激酶中的一個(gè)成員，在激活回路的蘇氨酸-229和疏水端蘇氨酸-389分別被磷酸化而激活。有活性的PKCζ協(xié)調(diào)增強(qiáng)這些殘基的磷酸化，從而誘導(dǎo)P70S6K的活化時(shí)間的延長ADDINNE.Ref.{B6FD444B-42AF-4663-9EFF-6DC083E780EE}[49]。因此aPKCs對(duì)P70S6K的活化發(fā)揮了重要的作用，但是在活性的PKCζ作用下，僅僅增強(qiáng)蘇氨酸-389殘基的磷酸化，不足以完全激活P70S6KADDINNE.Ref.{DC79630B-D153-4357-891E-FB26866CAF08}[49]，它需要與多種信號(hào)分子如PKB一起作用才可以完全活化P70S6K。4、細(xì)胞極性細(xì)胞極性是所有正常細(xì)胞所擁有的一種基本特性，覺得細(xì)胞形態(tài)的胞質(zhì)分子的不對(duì)稱分布，細(xì)胞極性的建立是組織發(fā)育至關(guān)重要的一步，細(xì)胞極性的喪失可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明PAR-3、PAR-6、PKCζ或PKCλ形成三元復(fù)合物對(duì)細(xì)胞極性的建立非常重要ADDINNE.Ref.{C25CA642-BA95-4920-88A1-9461CBC82C29}[50,51]，它們控制細(xì)胞間緊密連接的形成。而PKCζ-kn與PKCλ-kn擾亂ZO-1的定位ADDINNE.Ref.{FEEF6A57-4360-4D2F-B100-A28BAE41E9FF}[52]（ZO-1是緊密連接的成分），更為重要的是，PKCζ中的PB1結(jié)構(gòu)中的Asp殘基對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)完整性是關(guān)鍵性的，除了內(nèi)皮細(xì)胞外，PKCζ還控制遷移中的星形細(xì)胞的極性。三元復(fù)合體PAR-3/ASIP-PAR6-aPKC在其他類型細(xì)胞的極化中起到了基礎(chǔ)作用。在神經(jīng)細(xì)胞中，F(xiàn)EZ1對(duì)軸突發(fā)育的延長是很重要的，在一定的條件下，F(xiàn)EZ1和PKCζ共同刺激樹突的延長ADDINNE.Ref.{27AD357F-C72C-4CD3-85D8-CB25A3A41548}[53]，但是FEZ1單獨(dú)存在時(shí)不能產(chǎn)生這種作用。FEZ1被PKCζ磷酸化后從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)里ADDINNE.Ref.{574C7826-ED3E-4332-886E-9B59905CCF4C}[53]。PSD-ZIP70，位于突觸后密度和樹突棘中，與FEZ1有很大的同源性ADDINNE.Ref.{9CAE4CE2-539F-47E2-92C3-11951A794145}[54]。PKCζ與FEZ1/PSD-ZIP70在神經(jīng)突觸的延長及突觸后結(jié)構(gòu)的維持中發(fā)揮了重要作用，而且，腫瘤抑制基因8p22，在食道癌，前列腺癌，乳腺癌中編碼FEZ1ADDINNE.Ref.{D65E9330-5C66-4AC3-8CF1-A879CB347782}[55]，在內(nèi)皮細(xì)胞中FEZ1與微觀