發(fā)酵工程課件

第八章典型培養(yǎng)過程傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)重組菌培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)前面已講述很多，本章著重在后兩方面的介紹典型培養(yǎng)過程第一節(jié)基因工程菌培養(yǎng)一、概述基因工程菌生產(chǎn)的主要產(chǎn)品有二類，蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)。非蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以通過代謝工程細(xì)胞來獲得，這些細(xì)胞插入編碼酶的DNA，產(chǎn)生新的途徑或增強某一途徑，從而得到新的化合物或增加產(chǎn)量?，F(xiàn)代基因工程重點在蛋白質(zhì)產(chǎn)物上，主要產(chǎn)品如下：典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)細(xì)胞因子、疫苗、酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)

產(chǎn)品最主要的用于人的治療，此外還有用于畜牧業(yè)、食品或工業(yè)用的生物催化劑。用于注射用的治療蛋白要求高度純化，由于病人可能產(chǎn)生的強的免疫反應(yīng)或副作用是災(zāi)難性的。有的蛋白轉(zhuǎn)譯后還要進(jìn)行修飾，如糖基化、磷酸化后才有活性。治療蛋白最主要的是保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，降低成本并不重要，由于這些產(chǎn)品大多用量很小，價格高，附加值高。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)二、宿主-載體系統(tǒng)

構(gòu)建基因工程菌，必須選擇宿主和表達(dá)系統(tǒng)，一般希望翻譯后的處理要簡單，如果用于食品要考慮宿主菌是否列入FDA表中，列入的認(rèn)為是安全的菌。常用的宿主系統(tǒng)有：大腸桿菌

G+細(xì)菌低等真核細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)1、大腸桿菌如果產(chǎn)品翻譯后不需要修飾，大腸桿菌是最普遍選用的宿主。優(yōu)點：人們對大腸桿菌的生理學(xué)和遺傳學(xué)背景了解得比其他任何生物深。有利于進(jìn)行復(fù)雜的基因操作；大腸桿菌有相當(dāng)高的生長速率，并能長到高細(xì)胞濃度（50g/l）；大腸桿菌能生長在簡單的便宜的培養(yǎng)基上。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)這些因素給大腸桿菌許多經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢。但大腸桿菌不是完美的宿主。主要問題是大腸桿菌分泌(secretion)的蛋白通常在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)這些蛋白達(dá)到高濃度時，會被水解或形成不溶的包含體。其中主要是外源蛋白，但也含有其它細(xì)胞物質(zhì)。包含體中的蛋白是不折疊的，不折疊的蛋白沒有生物活性，必須重新溶解并使它復(fù)性。大量的外源蛋白的產(chǎn)生會觸發(fā)熱沖擊響應(yīng)。熱沖擊調(diào)節(jié)子的一種響應(yīng)是增加蛋白水解酶的活性。在一些情況下，細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶是使蛋白的降解速率幾乎等于產(chǎn)生的速率。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)2、G+細(xì)菌

枯草桿菌是可替代大腸桿菌的菌種，它是G+菌，它沒有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的這一性質(zhì)對生產(chǎn)非常有吸引力。然而枯草桿菌有許多問題妨礙它在商業(yè)上的采用。主要是枯草桿菌產(chǎn)生大量的蛋白酶，會很快降解產(chǎn)物。而且枯草桿菌基因構(gòu)建比大腸桿菌困難，質(zhì)粒穩(wěn)定性也比較差，所以在使用上有較大的限制，典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)3、低等真核細(xì)胞酵母菌釀酒酵母是第一個被人利用的生物，它的最大生長速率是大腸桿菌的25%，酵母比最大的細(xì)菌大，容易從發(fā)酵液中回收。酵母有簡單糖基化能力和分泌蛋白的能力。這些是它的優(yōu)點。但酵母達(dá)到高表達(dá)水平比大腸桿菌困難，外源蛋白分泌到胞外也有限，現(xiàn)在發(fā)展了其他的酵母如甲醇營養(yǎng)型酵母等。當(dāng)產(chǎn)生是外源蛋白需要復(fù)雜的糖基化和翻譯后修飾時，低等真核細(xì)胞就不能適應(yīng)，要用動物細(xì)胞組織培養(yǎng)來達(dá)到。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)4、哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞在表達(dá)時有正確的氨基酸排列，而且所有轉(zhuǎn)錄后處理與在整個動物中相同，在某種情況下可能轉(zhuǎn)錄后修飾有些不同但它可提供最接近于天然副本的產(chǎn)物，此外多數(shù)產(chǎn)物可以分泌到胞外。但動物細(xì)胞生長緩慢，培養(yǎng)基價格昂貴，蛋白表達(dá)水平較低。用于重組DNA生產(chǎn)蛋白的最常用的宿主是CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)三、利用基因工程菌生產(chǎn)的特點基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能在質(zhì)粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長快得多，這樣就會大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)四、基因不穩(wěn)定性生產(chǎn)的目標(biāo)是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對宿主細(xì)胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長得快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性?；虻牟环€(wěn)定性原因：分離丟失、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)1、分離丟失

當(dāng)細(xì)胞分裂時一個子細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒就出現(xiàn)分離丟失。質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)粒（>20拷貝/細(xì)胞）和低拷貝質(zhì)粒（有時低到每個細(xì)胞一至二個拷貝）。低拷貝質(zhì)粒有專門的機制保證在子代細(xì)胞中有相等的分配，高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細(xì)胞。對于高拷貝質(zhì)粒，幾乎所有子細(xì)胞接受一些質(zhì)粒，也有可能有的細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒，當(dāng)然形成無質(zhì)粒細(xì)胞的可能性是低的（每百萬細(xì)胞分裂中一個）。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)但在大的反應(yīng)器中含有非常多的細(xì)胞，總會存在無質(zhì)粒細(xì)胞，例如1000L發(fā)酵液，每毫升有109個細(xì)胞，總共就有1015個細(xì)胞，那么在這個反應(yīng)器中就含有109個無質(zhì)粒細(xì)胞。質(zhì)粒的分離丟失可能受許多環(huán)境因素影響，如溶氧、溫度、培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質(zhì)粒也會形成多聚體，它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個單位。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)2、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性

除了分離不穩(wěn)定性問題外，某些細(xì)胞保留質(zhì)粒，但質(zhì)粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而不產(chǎn)生外源蛋白，減少對細(xì)胞的有害影響，這就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。如果質(zhì)粒發(fā)生突變，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。而且由于不合成外源蛋白，生長得比原來的工程菌更快，使得在這種培養(yǎng)物中帶有改變了的質(zhì)粒占統(tǒng)治地位的菌，這種培養(yǎng)情況就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)3、宿主細(xì)胞突變

宿主細(xì)胞的突變也會造成生產(chǎn)能力的減少。這些突變通常改變細(xì)胞調(diào)節(jié)，結(jié)果減少目標(biāo)蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達(dá)的啟動子，利用宿主細(xì)胞的啟動子，如果宿主細(xì)胞啟動子的改變，將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過加入乳糖或它的結(jié)構(gòu)類似物（如IPTG）來啟動表達(dá)，如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會阻止乳糖或乳糖的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)入細(xì)胞，從而不能啟動細(xì)胞的表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)4、生長速率占優(yōu)勢的不穩(wěn)定性所有這三種因素的關(guān)鍵是改變了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主-載體系統(tǒng)的生長速率不同。如果改變了的宿主載體系統(tǒng)比原來的宿主-載體系統(tǒng)有生長優(yōu)勢，那么改變了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢，基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn)。表達(dá)的誘導(dǎo)基因工程菌的產(chǎn)物表達(dá)需要誘導(dǎo)，誘因主要有：溫度誘導(dǎo)、乳糖或乳糖結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)、氧饑餓誘導(dǎo)、葡萄糖饑餓誘導(dǎo)、甲醇誘導(dǎo)等。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)五、重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)策略關(guān)鍵點：高密度、高表達(dá)菌密度的測定：光密度（OD值或A值）在波長600～660菌生長的障礙是重組菌攜帶外源基因，加重代謝負(fù)擔(dān)，生長緩慢重組蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌體內(nèi)合成后就會造成積累。高表達(dá)的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白對菌體有害，對細(xì)胞生長有抑制作用，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞中毒或死亡,因此工程菌的比生長速率往往遠(yuǎn)小于宿主菌。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)高表達(dá)的障礙是：外源基因的不穩(wěn)定，造成表達(dá)的下降。高生長速率與高表達(dá)之間的矛盾乙酸的產(chǎn)生蛋白的降解典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)高密度培養(yǎng)的措施分批補料培養(yǎng)以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點，可消除高濃度底物對細(xì)胞生長的抑制作用，還可彌補低濃度底物限制細(xì)胞生長的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長過程。因此，要實現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批補料流加培養(yǎng)法?，F(xiàn)在常用的是反饋補料培養(yǎng)。有幾種反饋控制控制基質(zhì)濃度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生長速率的葡萄糖流加典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)1、控制基質(zhì)濃度流加用專門的電極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測發(fā)酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通過反饋系統(tǒng)與補糖單元相連。當(dāng)葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當(dāng)葡萄糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時，糖閥開啟，葡萄糖以一定速率加入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效應(yīng)，達(dá)到很高的細(xì)胞濃度。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)2、恒pH流加大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長，pH會上升。這是由于菌體分解LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，造成氨積累的原因。因此用葡萄糖代替酸液進(jìn)行恒pH流加。實驗通過pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使pH恒定，結(jié)果推遲了比生長速率的降低時間，細(xì)胞密度是無流加的2倍?？梢砸云咸烟谴嫠嵋?，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時流加氨水和葡萄糖。這種方法的缺點是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對某些工程菌不適宜。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)3、恒溶氧流加用復(fù)膜氧電極來控制補糖。當(dāng)培養(yǎng)液的氧飽和百分?jǐn)?shù)高于控制點，糖閥開啟，以一定速率補糖。加入的糖被菌利用則需要更多的氧，從而減少氧飽和百分?jǐn)?shù)，引起讀數(shù)下降。當(dāng)讀數(shù)下降到控制點以下，糖閥關(guān)閉，需氧就會隨之減少，氧的飽和百分?jǐn)?shù)逐漸上升，從而達(dá)到供需平衡。Konstantinov等進(jìn)一步發(fā)展了這種方法，用DO-state法間歇流加葡萄糖，通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達(dá)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)4、控制比生長速率的葡萄糖流加菌體的比生長速率與代謝產(chǎn)物的表達(dá)密切相關(guān)。比生長速率太大，超過某一值，易產(chǎn)生乙酸，這一比生長速率值稱為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長速率。通過考察得出最優(yōu)比生長速率，控制溶氧、轉(zhuǎn)速、補糖來控制比生長速率。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)六、生長與表達(dá)的影響因素

不同發(fā)酵條件下工程菌發(fā)酵結(jié)果通氣量攪拌轉(zhuǎn)速DOpHOD600

誘導(dǎo)時間菌體濕重蛋白量111501.87.00.741.913.8%222502.67.80.7742.0816.7%335003.87.50.7462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鯉魚生長激素基因工程菌典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)1、溶氧濃度對工程菌發(fā)酵的影響在鯉魚生長激素基因工程菌的發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液的溶氧為1.8~2.6ppm/L時，菌體濕重為1.9~2.08g/L外源基因表達(dá)量為13.8%~16.7%，而當(dāng)溶氧值提高到4.0ppm/L時菌體濕重為2.27g/L外源基因表達(dá)量為26.4%。在誘導(dǎo)表達(dá)期間，要維持外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯，細(xì)胞需要大量的能量代謝以促進(jìn)呼吸作用。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)2、pH值對工程菌生長和表達(dá)的影響在相同通氣量和攪拌速度下，pH值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達(dá)有一定影響。由于工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)工藝，前期為菌體生長階段，后期為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段。偏堿性的pH對外源蛋白的表達(dá)不利，因此，表達(dá)開始要調(diào)節(jié)pH在6.8-7.0之間，以保證外源蛋白的高水平表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)3、誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達(dá)的影響誘導(dǎo)時間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時間隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。誘導(dǎo)時間對酶表達(dá)水平和活力的影響誘導(dǎo)時間酶活力酶表達(dá)水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)4、誘導(dǎo)時機對表達(dá)的影響以天冬酰氨酶表達(dá)為例，見表。在A600=0.295*10時生長速度比較快，這時菌體進(jìn)入誘導(dǎo)狀態(tài)，酶蛋白的積累加快，酶活和表達(dá)水平都較高。而菌體進(jìn)入對數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長速度明顯受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo)，表達(dá)顯然受到影響。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)

誘導(dǎo)時機對酶表達(dá)水平和活力的影響生物量（A600）酶活力酶表達(dá)水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)5、乙酸對生長和表達(dá)的影響（1）乙酸的產(chǎn)生及抑制作用機理當(dāng)葡萄糖加入量超過菌體生長和二氧化碳產(chǎn)生所需要量或在缺氧的條件下便會產(chǎn)生大量的乙酸，特別是在培養(yǎng)時間較長的高密度發(fā)酵過程中，問題更為嚴(yán)重。乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)有關(guān)。Han認(rèn)為細(xì)菌在低比生長速率下通過氧化代謝的作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化的需求，不會產(chǎn)生乙酸，而在髙比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)乙酸的生成需要兩個關(guān)鍵性的酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應(yīng)。EL-Mansi和Luli假設(shè)的乙酸抑制機理是：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO－）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H＋，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差減小，減弱了質(zhì)子的推動力，產(chǎn)生的能量就被大大減少，擾亂了細(xì)胞的正常代謝和生理活性。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)（2）減少乙酸積累的對策宿主菌不同的宿主產(chǎn)生乙酸不同，可通過誘變使乙酸生成途徑中的兩個關(guān)鍵酶，有一個突變了或活性降低了，使乙酸合成受阻。培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成能影響乙酸的產(chǎn)生，特別是碳源的含量影響最大。在基本培養(yǎng)基中大腸桿菌產(chǎn)生的乙酸比在復(fù)合培養(yǎng)基中產(chǎn)生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培養(yǎng)基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）減輕了乙酸的抑制作用，提高了重組菌的生長速率和重組蛋白的產(chǎn)率。Klemam等研究了培養(yǎng)基pH值對產(chǎn)生乙酸的影響，發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌W3200在葡萄糖濃度為5g/L、pH6.0的培養(yǎng)基中乙酸生成量為6g/L.而pH7.5為12g/L。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)降低比生長速率細(xì)菌比生長速率高，乙酸的比生成速率就高，一般來說，在合成培養(yǎng)基中，當(dāng)重組菌的生長速率超過某個臨界值便產(chǎn)生乙酸。在連續(xù)培養(yǎng)中，當(dāng)稀釋速率超過0.2h－1才能檢測到乙酸的存在。較低的比生長速率雖然產(chǎn)酸少，但同時對產(chǎn)物表達(dá)不利，因此選取合適的比生長速率才能達(dá)到高密度、高表達(dá)發(fā)酵。降低培養(yǎng)溫度將溫度從370C降低到26-300C可以降低菌體對營養(yǎng)物的吸收率，從而減少有機酸的形成。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)透析培養(yǎng)在重組菌的培養(yǎng)過程中可以利用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中有害物質(zhì)，降低乙酸的含量從而實現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵。Lee等用中空纖維膜過濾裝置除去乙酸，可以在較高的葡萄糖濃度下培養(yǎng)重組菌而得到較高的密度限制性流加葡萄糖利用葡萄糖為碳源培養(yǎng)重組大腸桿菌時要控制其濃度在較低的范圍內(nèi)，減少乙酸的生成。目前大多數(shù)高密度發(fā)酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法利用反饋的參數(shù)，如pH，μ，OUR,CER作為控制對象，和葡萄糖流加相關(guān)聯(lián)，控制流加量，使培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度限定在較低水平。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)七、甲醇營養(yǎng)型酵母的生長和表達(dá)

（一）酵母作為宿主菌的優(yōu)點單細(xì)胞低等真核生物，易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工的功能，具有適合于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)分泌外源蛋白質(zhì)到培養(yǎng)液中，利于純化。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)

釀酒酵母最先內(nèi)用來作為外源基因的表達(dá)宿主菌之一，由于人們對釀酒酵母（S.Cerevisiae）的遺傳學(xué)和生理學(xué)背景了解得多，及其表達(dá)的安全性。但釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)也存在一些問題：一是缺乏強有力的嚴(yán)格調(diào)控的啟動子。目前一些常用的啟動子很難精確控制或需要大量昂貴的誘導(dǎo)物，如半乳糖苷酶啟動子需要半乳糖的誘導(dǎo)；二是分泌效率低，特別是對分子量大于30KD的外源蛋白幾乎不分泌；三是表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失；四是不適于高密度培養(yǎng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)（二）甲醇營養(yǎng)型酵母甲醇營養(yǎng)型酵母主要包括Candida、Torulopsis、Hansenula、Pichia。用作表達(dá)宿主株的主要是Hansenula和Pichia?；谝陨系膯栴}，人們發(fā)展了甲醇營養(yǎng)型酵母作為第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)甲醇營養(yǎng)型酵母的重要特性是能利用甲醇作為唯一的碳源和能量來源。因為甲醇能誘導(dǎo)其表達(dá)甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶（AlcoholOxidase,AOX）二羥丙酮合成酶（Dihydroxy-acetonesynthase,DHAS）和過氧化氫酶（Catalase），表達(dá)的DHAS的含量甚至可達(dá)到總細(xì)胞蛋白的60-80%。而當(dāng)以葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源時，AOX幾乎不表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，AOX的表達(dá)是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其啟動子能非常有效地控制外源基因的表達(dá)。已經(jīng)在P.pastoris染色體中鑒定了二個AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1編碼的蛋白質(zhì)與AOX2編碼的蛋白質(zhì)有97%的同源性，但AOX1基因的啟動子（PAOX1）受甲醇強烈誘導(dǎo)，而PAOX2則很弱。H.polymorpha染色體只有一個AOX基因，也受甲醇調(diào)節(jié)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)甲醇營養(yǎng)性酵母的另一個特點是甲醇代謝所需的三種酶被分揀轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體中，形成區(qū)域化。在葡萄糖為碳源時，菌體中只有一個或幾個很小的過氧化物酶體，而在甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎占到整個細(xì)胞體積的80%，里面的蛋白質(zhì)主要AOX和DHAS。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表達(dá)乙型肝炎表面抗原以來，短短幾年間，至少有40多種外源蛋白在P.pastoris和H.polymorpha中獲得表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中或聚集在胞漿，表達(dá)量最高的可達(dá)全菌蛋白的32%或每升12g產(chǎn)物。H.polymorpha表達(dá)比P.pastoris有更多的優(yōu)點，如更高的耐熱性（理想溫度為37-430C，而P.pastoris為300C）和在甲醇誘導(dǎo)下更快的生長速率，可減少培養(yǎng)時間，降低污染機會。H.polymorpha更適于大分子量蛋（150KD）的表達(dá)與分泌。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)為了提高外源表達(dá)蛋白在酵母細(xì)胞中的穩(wěn)定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下幾種方法：一是在培養(yǎng)液中補加一些富含氨基酸的組分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，提高給酵母細(xì)胞蛋白酶過量的底物，以減少目的蛋白的水解；二是由于P.pastoris能耐受較寬的pH范圍（pH3.0-7.0），因此可調(diào)培養(yǎng)液pH值抑制蛋白水解酶活性；三是改造P.pastoris表達(dá)宿主菌株，缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白穩(wěn)定。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)酵母細(xì)胞是真核生物，具有一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如過氧化物酶體等，它們對細(xì)胞的功能極端重要，過氧化物酶體內(nèi)不含DNA，也無蛋白質(zhì)合成機制，所有過氧化物酶體內(nèi)的蛋白都由核基因編碼表達(dá)，再轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體。因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中必定存在一些進(jìn)入過氧化物酶體所必須的局部信息。如果把表達(dá)的外源蛋白運輸進(jìn)入過氧化物酶體儲存起來，不僅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其穩(wěn)定性，還可減少外源蛋白對宿主的毒害作用。一些實驗表明，甲醇營養(yǎng)型酵母分揀外源蛋白進(jìn)入過氧化物酶體，使之區(qū)域化的信號。已鑒定出二種分揀進(jìn)入過氧化物酶體所需的靶信號PTS1和PTS2。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)由于甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一些特殊的優(yōu)點（1）應(yīng)用AOX啟動子，轉(zhuǎn)錄效率高，易于誘發(fā)調(diào)控；（2）表達(dá)質(zhì)粒易于整合到基因組，不易丟失，適于高密度發(fā)酵，產(chǎn)量高；（3）表達(dá)產(chǎn)物分揀進(jìn)入過氧化物酶體等因此最近十幾年來，人們越來越多的應(yīng)用它作為外源基因表達(dá)的系統(tǒng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)（三）甲醇營養(yǎng)型酵母培養(yǎng)中的影響因素1、甲醇濃度對基因工程菌P.Pestoris表達(dá)rHSA的影響按搖瓶培養(yǎng)方法每24h分別補加甲醇使其在培養(yǎng)基中濃度為5、10、20、30、40、50g／L誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，結(jié)果見表2(表中數(shù)據(jù)為2個發(fā)酵瓶平均值)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)

在甲醇濃度為10g／L時畢赤酵母表達(dá)目的蛋白量達(dá)到最高，這可能是當(dāng)甲醇濃度小于10g／L，甲醇成為限制性底物，限制了蛋白的表達(dá)當(dāng)濃度高于20g／L時，甲酵濃度過高，對目的蛋白的表達(dá)也有抑制作用。因此，在搖瓶條件下，甲醇的最佳誘導(dǎo)濃度為10g／L。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)2、pH對基因工程菌P.Pastoris表達(dá)rHSA的影響按搖瓶培養(yǎng)方法把菌種接至用0.2mol/L的磷酸緩沖液配制好的搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中pH分別為5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至終濃度10g／L進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)由基因工程菌P.Pastoris表達(dá)目的蛋白和細(xì)胞光密度曲線(圖1)可以看出pH為5.84時目的蛋白表達(dá)量最高。pH為5.43時，目的蛋白基本沒有表達(dá)，但細(xì)胞光密度極大，說明在低pH值條件下，適合細(xì)胞生長而不適合目的的蛋白表達(dá)；當(dāng)pH值在5.72—7.00時，細(xì)胞光密度基本相同，而目的蛋白表達(dá)量基本是呈逐漸下降的趨勢，pH為7.05時，目的蛋白表達(dá)量明顯下降。因此，既利于P.Pastoris細(xì)胞生長又利于目的蛋白高表達(dá)的pH范圍為5.72—6.59。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)3、接種量對基因工程菌P.Pastoris表達(dá)rHSA的影響在用重組畢赤酵母生產(chǎn)人骨唾液酸蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物表達(dá)量與接種量有關(guān)。在BMGY中培養(yǎng)菌體至A600為9，離心后水洗，分別用4、2、1、1／2、1／5、1／10倍體積BMMY(1％甲醇)重懸，進(jìn)行2d的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明產(chǎn)量隨發(fā)酵密度增大而明顯提高，重懸于1／5體積的BMMY中(相當(dāng)于菌體吸收度A600約45)的表達(dá)量最高，為0.204g／L，但增大到A600為90時，表達(dá)量有所下降(見圖2)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)4、(NH4)2SO4濃度對蛋白表達(dá)的影響氮源是宿主菌合成異源蛋白所必須的成分，試驗不同濃度的(NH4)2SO4對菌體生長的影響，所得結(jié)果見圖l。(NH4)2SO4濃度太高或太低都會對蛋白的表達(dá)產(chǎn)生不利影響。當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于50mg／L時，蛋白的表達(dá)很明顯受到限制，而(NH4)2SO4濃度高于3.0g／L時則會抑制蛋白表達(dá)。另外由于目前高密培養(yǎng)P.Pastorisr表達(dá)白蛋白通常只補加碳源和微量元素，而只以流加氨水調(diào)節(jié)pH來補充氮源。但誘導(dǎo)過程中pH下降很少，因而補充的氮源也很少，可能會限制菌的生長和白蛋白的分泌。由圖1也可以看出開始誘導(dǎo)后每24h補加(NH4)2SO4

，使其濃度維持在2g/L左右，蛋白表達(dá)量最大。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)5、微量量元素PTM1的影響對比加入PTM1與不加PTM1所分泌的總蛋白，前者明顯高于后者，這說明加入PTM1能夠明顯提高rHSA的表達(dá)，從圖3可知，總蛋白質(zhì)量濃度由119.0mg／L增加到192.3mg／L，增加了61.6％。這是因為微量元素中含有Ca2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Mg+等金屬離子，還有Co2+、I-、Mo2+在微生物培養(yǎng)中經(jīng)常使用這些金屬離子，有助于提高培養(yǎng)的細(xì)胞濃度、細(xì)胞得率和細(xì)胞產(chǎn)率；前24h白蛋白量增加迅速，此后增加緩慢，至60h達(dá)最高，然后呈下降趨勢，可能是產(chǎn)生的蛋白酶分解了所分泌的白蛋白。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)總結(jié)：基因工程菌在代謝控制方面與傳統(tǒng)微生物有許多相似之處，比如補料控制、pH控制、溫度控制、溶氧控制等，使菌體能夠達(dá)到高密度。它的特殊之處在于外源基因的穩(wěn)定性、外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)、蛋白降解的防止以及生長與表達(dá)的協(xié)調(diào)等方面，以達(dá)到高表達(dá)的目的。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)思考題1、利用基因工程菌生產(chǎn)，有什么優(yōu)勢？常用的宿主菌有哪些？2、利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點？3、重組菌基因不穩(wěn)定性的原因有哪些？4、在基因工程菌培養(yǎng)過程中為什么質(zhì)粒會丟失？5、基因工程菌高表達(dá)的障礙是什么？6、常規(guī)的高密度培養(yǎng)的措施有哪些？重組菌與傳統(tǒng)微生物在產(chǎn)物表達(dá)上有什么區(qū)別？與大腸桿菌相比酵母作為宿主菌有什么優(yōu)點？重組菌與傳統(tǒng)菌在發(fā)酵過程控制中有哪些相同之處？重組大腸桿菌的誘導(dǎo)因子有哪些？重組酵母的誘導(dǎo)因子有哪些？典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)第二節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的總體差異內(nèi)容微生物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞壁普遍存在存在生長速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低營養(yǎng)要求普遍簡單復(fù)雜CO2需求一些微生物需CO2許多需要CO2形成緩沖液環(huán)境影響小大大小范圍100~2000nm10000~100000nm接種濃度低高（10-5.ml-1）生長濃度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動物細(xì)胞培養(yǎng)是指在合適的培養(yǎng)條件下，動物細(xì)胞離體生長和增殖，并保持其特性和功能的技術(shù)，這些細(xì)胞不再形成組織。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)

1細(xì)胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2細(xì)胞大，無細(xì)胞壁，機械強度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3需氧少，不耐受強力通風(fēng)與攪拌

4群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性）

5培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，成本高

6原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)兩個專業(yè)術(shù)語細(xì)胞系：首次分離組織的培養(yǎng)稱之為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代成功后即成細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生長的類型貼壁依賴性來自動物實體組織的大多數(shù)細(xì)胞需要貼壁單層生長。只要它們沒有轉(zhuǎn)化為非貼壁依賴性的必須貼伏在合適的固體介質(zhì)上并鋪展，才能生長。非貼壁依賴性細(xì)胞無需貼附到固體介質(zhì)上就能生存和生長的細(xì)胞。來自血液、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常為非貼壁依賴性的，它們形態(tài)呈圓形。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)生長特性：貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液；細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品。

●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。

●適用于所有類型細(xì)胞。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng).貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長；

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞培養(yǎng)物的獲得原代培養(yǎng)物在無菌條件下，用鑷子和剪刀將切下的組織碎成小塊，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶處理，使組織解離成單個細(xì)胞，放入培養(yǎng)容器中無菌培養(yǎng)。這種原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細(xì)胞類型，它們的生長速率不同，成纖維細(xì)胞最易生長，常會在此后的傳代培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢。仔細(xì)控制培養(yǎng)基的成分，可以選擇性地支持某些細(xì)胞類型的生長。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常細(xì)胞經(jīng)過一個轉(zhuǎn)化的過程，喪失了對生長控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長，但可能生長到不止單層。細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化②化學(xué)轉(zhuǎn)化。某些化學(xué)致癌物會增加轉(zhuǎn)化頻率③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用于生成生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對她們的安全性仍然非常關(guān)心，對可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測和控制。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞使來自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長速率高。對生長因子的依賴程度低，對培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。。腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識，對其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療，C127細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)所需的一般條件適宜的培養(yǎng)皿血清成分370CCO25％95～100％濕度抗生素典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基配置考慮的因素的pH多數(shù)細(xì)胞系在pH7.4下生長得很好。一些正常的成纖維細(xì)胞系以7.4~7.7最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以pH7.0~7.4更合適。緩沖在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)溫度低溫下CO2溶解度增加，引起pH變化。黏度培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚己烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成1、水細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來配置，對水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，單原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細(xì)胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降解量與時間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對細(xì)胞有毒性。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)3、氮源氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類的細(xì)胞對氨基酸的種類和濃度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，還有12種氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時常會增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)4、維生素維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或輔酶，對細(xì)胞的代謝過程有重要影響。5、無機離子無機離子分為兩組，一種是含量較高的，，包括維持膜電勢的（Na+，K+），維持滲透壓平衡（Na+，Cl－），作為酶的輔因子（Mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（Mg2+Ca2+），起緩沖作用（HPO42-，HCO3-）；另一種勢微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)6、脂類和磷脂前體在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對某種脂類有很高的依賴性。非營養(yǎng)性物質(zhì)1、抗生素細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH緩沖劑最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與5％～10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。HEPES是緩沖能力很強的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)3、酚紅酚紅普遍作為培養(yǎng)基的pH指示劑4、保護(hù)劑細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會受到機械攪拌和氣泡運動所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。5、還原劑某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)胱氨酸利用。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)三、細(xì)胞計數(shù)及活力測定

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)四、培養(yǎng)物的污染及防止污染途徑

1空氣：空氣流動性大，如果培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。無菌操作應(yīng)在凈化臺內(nèi)進(jìn)行，工作時要帶口罩

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)2器材：各種培養(yǎng)器皿

3操作：實驗操作無菌觀念不強，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)五、動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（一）培養(yǎng)環(huán)境1、溫度溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動物細(xì)胞，其最適的生長溫度不同。例如昆蟲細(xì)胞的最適溫度是25～280C，人和哺乳動物細(xì)胞的最適溫度是370C，細(xì)胞代謝強度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)2、pH大規(guī)模培養(yǎng)時影響培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（1）緩沖液的緩沖能力及種類（2）對流空間大小（3）葡萄糖濃度培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其pK為6.1，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對流空間加入CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對動物細(xì)胞有毒害作用。HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于HEPES的pK為7.0，HEPES被加入后，其緩沖能力為pH6.8～7.2。。但是當(dāng)HEPES濃度高于25mmol/L時，它對大多數(shù)動物細(xì)胞都有毒害作用。動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時常有幾種方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH：（1）在培養(yǎng)基中添加NaHCO3作為緩沖劑及通入含CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié)典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于動物細(xì)胞培養(yǎng)時要求低攪拌和弱混合，利用NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)時會發(fā)生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動物細(xì)胞培養(yǎng)時不太合適。通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中CO2濃度來控制發(fā)酵過程的pH。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)3、溶解氧大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣得得目的有兩個：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)（三）培養(yǎng)容器1、多孔板、Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、滾瓶也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時放在滾瓶機上緩慢滾動，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積交大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。3、生物反應(yīng)器是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從1升到幾十立方米。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)微載體微載體是指直徑在60～250μm、適合于動物細(xì)胞貼附和生長的微珠。微載體法培養(yǎng)動物細(xì)胞有很多好處;①可在反應(yīng)器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了各種環(huán)境因素的檢測和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)⑥容易收獲細(xì)胞。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點是：①細(xì)胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長②微載體價格較貴，一般不能重復(fù)使用③需要較高的細(xì)胞接種量。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長的過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但由于動物細(xì)胞對攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計和操作上又有特殊要求如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的剪切作用，并通過表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)目前，動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡單，無轉(zhuǎn)動部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機會；產(chǎn)生的湍動溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小；當(dāng)大容易；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)成分混合均勻。存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機械損傷典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)通氣攪拌生物反應(yīng)器根據(jù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點，要求攪拌器轉(zhuǎn)動時混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計有多種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器?；\式攪拌器有兩個由200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部的是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)攪拌器有三個導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動時，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再從三個導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。在微載體法培養(yǎng)貼壁動物細(xì)胞時，一般攪拌轉(zhuǎn)速在30～60r/min范圍內(nèi)，混合時間為12～24s。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理條件的體外生長微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細(xì)胞的毒害作用。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點是：

●占地空間少；

●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級；

●生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細(xì)胞。

典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)由動物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮氣的比例來實現(xiàn)控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的pH值，它主要是靠預(yù)先加入培養(yǎng)基＝液中適量的碳酸氫鈉和通過改變氣體流量中的二氧化碳含量來實現(xiàn)。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培炎，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一定時間反應(yīng)后，將整個反應(yīng)系取出。流加培養(yǎng)流加培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝。到反應(yīng)終止時，取出整個反應(yīng)系。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補充新的營養(yǎng)成分，在按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)操作。這是反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液體積保持不變的操作方式。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。與分批培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)不同，連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長時間的穩(wěn)定。因此，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞時必需保持給細(xì)胞補充足夠的營養(yǎng)以及去除有毒的代謝廢物。通過調(diào)節(jié)灌注速率可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢物代謝低于抑制水平的狀態(tài)下。一般在分批培養(yǎng)中細(xì)胞密度為（2！4）×106cell/ml，在灌注系統(tǒng)中可達(dá)到（2～5）×107cell/ml。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基研究進(jìn)展——無血清培養(yǎng)基通常動物細(xì)胞的生長均有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分細(xì)胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源、不同批號蛋白含量差異大及價格高等，給生物制品的生產(chǎn)造成了不利。這就引發(fā)了人們對無血清培養(yǎng)基的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等，不少細(xì)胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長，尤其是CHO、雜交瘤及重組骨髓瘤細(xì)胞等。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)其中胰島素是無血清培養(yǎng)基中促進(jìn)動物細(xì)胞生長的最重要的多肽。CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。在人類細(xì)胞培養(yǎng)中，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基還能有選擇性地控制及避免成纖維細(xì)胞的過度生長。某些細(xì)胞在無血清的條件下，其生長和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。另外．動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用無血清培養(yǎng)基的成功，還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。典型過程培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)第二章：菌種的來源微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一些工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌種的特點自然界中有目的微生物分離的原則菌種選育、分子育種菌種的來源第一節(jié)微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝

有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長菌種的來源微生物的特性及工業(yè)微生物的要求二：工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求菌種的來源微生物的特性及工業(yè)微生物的要求放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動物來源一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：第二節(jié)已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉(zhuǎn)折點：菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開發(fā)一個新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗。關(guān)于食品用酶，美國需要得到FDA的批準(zhǔn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹三、常用的基因表達(dá)系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門氏菌

生長迅速、蛋白產(chǎn)量高;

表達(dá)蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導(dǎo)入相對容易；

已建立了整套表達(dá)理論及技術(shù).菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹(二)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

酵母(既是微生物又是真核細(xì)胞)

生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；

安全性好；

比哺乳動物細(xì)胞操作簡單；

具有一定的修飾蛋白的能力。菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)

具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能；

具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；

具有重組基因的高效擴增和表達(dá)能力；

具有貼壁生長特性，也可進(jìn)行懸浮生長；

CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹微生物（包括動、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：菌種的來源已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第三節(jié)自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過程土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則二、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結(jié)合產(chǎn)品的特點

標(biāo)簽：地點、時間、氣候等菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分類學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養(yǎng)的方法菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則四、菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則實例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選（國家七五攻關(guān)項目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則五、目的微生物富集方法的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學(xué)院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則第四節(jié)菌株選育、分子改造目的

提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實際問題

防止菌種退化菌種的來源菌株選育、分子改造方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進(jìn)化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等菌種的來源菌株選育、分子改造自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育菌種的來源菌株選育、分子改造自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？菌種的來源菌株選育、分子改造自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗菌種的來源菌株選育、分子改造二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{菌種的來源菌株選育、分子改造（二）、誘變劑處理過程中幾個有關(guān)的問題

化學(xué)誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH菌種的來源菌株選育、分子改造（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機篩選

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。菌種的來源菌株選育、分子改造HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型菌種的來源菌株選育、分子改造黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l菌種的來源菌株選育、分子改造三、基因的直接進(jìn)化(directedevolution)

突變

基因突變庫的建立

篩選

基因突變庫的篩選

基因復(fù)制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標(biāo)基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。菌種的來源菌株選育、分子改造主要應(yīng)用：酶學(xué)性能的提高:pH

溫度

有機溶劑生理環(huán)境→工業(yè)催化環(huán)境

底物專一性菌種的來源菌株選育、分子改造脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來源菌種的來源菌株選育、分子改造菌種的來源菌株選育、分子改造定點突變錯位PCR菌種的來源菌株選育、分子改造DNAShuffling:指DNA分子的體外重排，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。菌種的來源菌株選育、分子改造XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling菌種的來源菌株選育、分子改造菌種的來源菌株選育、分子改造項目進(jìn)化速度進(jìn)化對象進(jìn)化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較類型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNAShuffling技術(shù)的研究成果菌種的來源菌株選育、分子改造本章小節(jié)：

涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物(動、植物)才具有大量表達(dá)的潛力；

傳統(tǒng)的誘變方法仍然是一種采用的方法，特別是自然選育是工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要保證；

目前土壤中已分離的微生物不到總數(shù)的1%，微生物的多樣性仍然是以后若干年的研究重點；

基因重組、直接進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用，大大加快了生