第08章 真核生物的遺傳分析

第八章真核生物的遺傳分析1本章要掌握的主要內(nèi)容第一節(jié) 真核生物基因組及其復(fù)雜性真核生物基因組的特點反復(fù)序列的分類DNA序列分析方法與構(gòu)造基因組學(xué)第二節(jié) 基因家族基因家族的類型，基因家族的特點第三節(jié) 遺傳標(biāo)志2第一節(jié) 真核生物基因組及其復(fù)雜性3一、真核生物基因組的特點真核生物基因組〔EukaryoticGenome,EG〕與原核生物基因組〔ProkaryoticGenome,PG〕相比有很大差別：〔1〕EG位于細胞核中，由數(shù)條具有多級空間構(gòu)造的染色體組成；〔2〕具有多個復(fù)制起點，基因內(nèi)有內(nèi)含子；〔3〕存在著大量的非編碼DNA序列；4〔4〕編碼蛋白質(zhì)的基因多位于單拷貝序列中，同時還有大量的反復(fù)序列；〔5〕具有基因家族和基因簇；〔6〕具有生命所必需的細胞器基因組5二、基因組序列的分類〔一〕單一序列〔Uniquesequence〕又稱非反復(fù)序列〔nonrepetitivesequence〕，在基因組中只需一個或幾個拷貝的DNA序列，大多數(shù)構(gòu)造基因都屬于這一類。6〔二〕反復(fù)序列1、串聯(lián)反復(fù)DNA序列只存在于真核基因組，由2~200bp的反復(fù)單位組成7可變數(shù)目串聯(lián)反復(fù)序列Variablenumberoftandemrepeat,VNTR衛(wèi)星DNA中，有一類反復(fù)單位在11~60bp，總長度為幾百到幾千bp的反復(fù)序列，多位于近端粒處根據(jù)反復(fù)單位的大小又可分為：衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA三類，這類DNA多不具備轉(zhuǎn)錄才干8〔二〕反復(fù)序列1、串聯(lián)反復(fù)DNA序列衛(wèi)星DNA〔SatelliteDNA〕在進展密度梯度離心時，某些高度反復(fù)DNA序列由于堿基組成和浮力密度與主體DNA有區(qū)別，會構(gòu)成一系列的衛(wèi)星帶主帶：多由單拷貝序列組成，GC含量接近于基因組均值衛(wèi)星DNA9衛(wèi)星DNA普通位于異染色質(zhì)區(qū)，通常位于著絲粒在染色體中能夠有某種構(gòu)造功能長度為100kb~數(shù)Mb10小衛(wèi)星DNA中心反復(fù)序列由10~25bp組成總長度為0.1~30kb多位于接近染色體末端的區(qū)域，也稱端粒小衛(wèi)星，11微衛(wèi)星DNA由1~6個核苷酸為中心序列分散于整個基因組總長度<150bp12〔二〕反復(fù)序列2、分布的反復(fù)DNA序列在高度分散的反復(fù)DNA家族中含有少量轉(zhuǎn)座元件，根據(jù)大小不同，可分為短分布核元件〔shortinterspersednuclearelement,SINE〕長分布核元件〔longinterspersednuclearelement,LINE〕13三、DNA序列分析方法DNA測序技術(shù)早在DNA雙螺旋構(gòu)造(WatsonandCrick,1953)發(fā)現(xiàn)后不久就有報導(dǎo)(Whitfeld,1954)，當(dāng)時的測序的方法為降解法(sequencingbydegradation,SbD)，但由于操作復(fù)雜，并沒有構(gòu)成規(guī)模化的運用。141965，Cornall大學(xué)以S．W．Holle為首的科學(xué)家小組，初次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，經(jīng)分別純化后，再分別測定短片段順序。151968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士〔Dr．RayWu〕獨創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的引物一延伸測序戰(zhàn)略，并于1971年初次勝利地測定了λ噬菌體兩個COS末端的完好序列；1977，F(xiàn).Sanger在該戰(zhàn)略的根底上，開展出了快速測定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采用他的方法，完善了PCR擴增DNA的方法；M．Smith發(fā)明了堿基定點突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎。16Sanger等(1977)：末端終止法，該技術(shù)引入了聚合酶和測序膠，使DNA測序走向了大規(guī)模適用化。經(jīng)過Melamede,1985;Cheesman,1991;Metzkeretal.,1994等改良后成為迄今為止運用最為廣泛的測序技術(shù)。隨著技術(shù)的改良和創(chuàng)新(Juetal.,2000;Church,2002;Barnesetal.,2002;Mitraetal.,2003)，聚合酶測序法又有了新的開展。17另外，還有許多其他的測序戰(zhàn)略：如銜接酶測序法(sequencingbyligation,SbL)(Whiteleyetal.,1984;LandegrenandHood,1988;Drmanac,1992)、焦磷酸測序法(pyrosequencing)(Hyman,1988)雜交測序法(sequencingbyhybridization,SbH)(Drmanacetal.,1989;1998;2001)181、Sanger測序法

雙脫氧末端終止法利用DNA聚合酶的兩種酶催反響特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補鏈；2、利用2’，3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法，或酶催引物合成法。19反響：同時參與引物和模板、DNA聚合酶I、一種ddNTP、以及四種dNTP〔有一種帶放射性標(biāo)志〕。變性膠電泳分別反響混合物。放射自顯影術(shù)，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。20GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC21在實踐的DNA合成反響中，運用失去了5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當(dāng)?shù)卣{(diào)整ddNTP和dNTP的比例，便可以獲得良好的電泳譜帶方式。dNTP／ddNTP=1：100時，譜帶分別效果較佳，可讀出多于200個以上的核苷酸順序。222、化學(xué)降解法1977年由美國哈佛大學(xué)的A．M．Maxam和W．Gilbert發(fā)明，于1980年獲得諾貝爾化學(xué)獎23原理1、利用末端標(biāo)志使待測DNA帶放射性，2、利用不同化學(xué)藥品使DNA分別在特定堿基處斷裂，3、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分別各組大小不同的DNA片段，根據(jù)特定的斷裂位置讀出DNA序列2425第二節(jié) 基因家族真核基因組中來源一樣，構(gòu)造類似，功能相關(guān)的一組基因。能夠由某一共同祖先基因(ancestralgene)經(jīng)反復(fù)(duplication)和突變產(chǎn)生。家族成員可以分布于不同染色體上可集中于一條染色體上，串聯(lián)陳列在一同，構(gòu)成基因簇(genecluster)有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因(Pseudogene)26根據(jù)分布方式分基因簇和分布的基因家族：A基因簇〔genecluster〕基因家族的各個成員嚴密成簇陳列成大段的串聯(lián)反復(fù)單位，分布在某一條染色體的特殊區(qū)域；它們可同時發(fā)揚作用，合成某些蛋白質(zhì)。如組蛋白基因家族聚集在第7號染色體長臂3區(qū)內(nèi)27Histonegenefamily組蛋白基因家族28假基因〔pseudogene〕：具有與功能基因類似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，所以假基因是沒有功能的基因，用ψ表示。來源：普通以為是由mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后整合在基因組中，假基因不含內(nèi)含子。2930B分布的基因家族〔interspersedgenefamily〕概念：一個基因家族的不同成員成簇地分布不同染色體上，各成員在序列上有明顯差別。這些不同成員編碼一組功能上嚴密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族。31根據(jù)基因家族在基因組中的復(fù)雜程度分類321〕簡單基因家族◆特點：家族成員串聯(lián)陳列在一同組成一個轉(zhuǎn)錄單位◆代表:rRNA基因家族(反復(fù)單元28S、18S、5.8s-rRNA)332〕復(fù)雜基因家族◆特點：相關(guān)基因家族陳列在一同，之間有間隔序列，獨立的轉(zhuǎn)錄單位◆代表:組蛋白基因家族間隔區(qū)343〕發(fā)育相關(guān)復(fù)雜基因家族◆特點：分布在不同的染色體上獨立的轉(zhuǎn)錄單位基因順序與表達順序相關(guān)◆代表:珠蛋白基因家族35根據(jù)基因家族成員序列的類似程度分類A經(jīng)典的基因家族，家族成員序列有高度的同源性，序列一致，拷貝數(shù)高，非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)短而一致。B基因家族各成員的編碼產(chǎn)物保守〔大段的高度保守氨基酸序列〕；只是DNA序列的類似性低。C基因家族各成員的編碼產(chǎn)物之間只需很短的保守氨基酸序列，DNA序列的類似性更低。D超基因家族，各基因序列之間無同源性，但其基因產(chǎn)物的功能類似。編碼產(chǎn)物之間也無明顯的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。36第三節(jié)遺傳標(biāo)志一、遺傳標(biāo)志的開展二、分子遺傳標(biāo)志三、分子遺傳標(biāo)志的運用37一、遺傳標(biāo)志的開展1、形狀學(xué)標(biāo)志2、細胞遺傳標(biāo)志3、生化與免疫遺傳標(biāo)志4、分子遺傳標(biāo)志5、理想的分子遺傳標(biāo)志應(yīng)具備的特點381、形狀學(xué)標(biāo)志形狀學(xué)標(biāo)志(morphologicalmarker)可以用肉眼識別和察看、明確顯示遺傳多樣性的外觀性狀。特點簡單直觀，但標(biāo)志數(shù)目少，多態(tài)性低，易受外界條件的影響；根據(jù)它進展選擇的準(zhǔn)確性差，所需時間較長，選擇效率也較低。39古代形狀學(xué)標(biāo)志公元前4000年，伊拉克的古代巴比倫石刻上記載了馬頭部性狀在５個世代的遺傳。40伯樂相馬按圖索驥412、細胞遺傳標(biāo)志細胞遺傳標(biāo)志(cytologicalgeneticmarker)主要是指染色體核型〔染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等〕、帶型〔Q、G、C、R帶型〕和數(shù)量特征的變異等，它們分別反映了染色體在構(gòu)造上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。42家豬X、Y染色體G帶表示圖43細胞遺傳標(biāo)志的特點不易受環(huán)境影響，呈孟德爾方式遺傳。多態(tài)性集中表如今染色體高度反復(fù)DNA構(gòu)造的異染色質(zhì)所在的部位。細胞遺傳標(biāo)志經(jīng)常伴有對生物有害的表型效應(yīng)，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)志資料，或者觀測和鑒定比較困難，從而限制了細胞遺傳標(biāo)志的運用。443、生化與免疫遺傳標(biāo)志免疫遺傳學(xué)標(biāo)志(immunogeneticalmarker)以動物的免疫學(xué)特性為標(biāo)志，包括紅細胞抗原多態(tài)性和白細胞抗原多態(tài)性。生化遺傳標(biāo)志(biochemicalgeneticmarker)主要是指在同一動物個體中具有一樣功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體。45生化與免疫遺傳標(biāo)志的特點與形狀學(xué)標(biāo)識和細胞遺傳標(biāo)志相比，數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小，檢測手段簡便，是一種較好的遺傳標(biāo)志。血液型和蛋白質(zhì)型都是基因表達的產(chǎn)物，局限于反映基因組編碼區(qū)的遺傳信息，且標(biāo)志的數(shù)量還比較有限，不能很好地覆蓋整個基因組。464、分子遺傳標(biāo)志分子遺傳標(biāo)志(moleculargeneticmarker)是一種新的以DNA多態(tài)性為根底的遺傳標(biāo)志.隨著分子生物學(xué)的開展，相繼建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多種分子遺傳標(biāo)志檢測技術(shù)，開創(chuàng)了遺傳標(biāo)志研討的新階段。47分子遺傳標(biāo)志的特點無表型效應(yīng)不受環(huán)境的限制和影響普遍存在于一切生物數(shù)量豐富48理想的分子遺傳標(biāo)志應(yīng)具備的特點遺傳多態(tài)性高;檢測手段簡單快捷，易于實現(xiàn)自動化;遺傳共顯性，即在分別群中可以分別出等位基因的3種基因型。標(biāo)志遍及整個基因組；準(zhǔn)確性，能正確反映動物的真實遺傳，即標(biāo)志是經(jīng)濟性狀基因，還是與影響重要性的性狀連鎖。實驗反復(fù)性好〔便于數(shù)據(jù)交換〕；開發(fā)本錢和運用本錢盡量低廉；49二、分子遺傳標(biāo)志1、RFLP：限制性片段長度多態(tài)性2、TRS：串聯(lián)反復(fù)序列標(biāo)志3、SNP：單核苷酸多態(tài)性501、限制性片段長度多態(tài)性RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism最早運用于動植物遺傳學(xué)研討的分子標(biāo)志技術(shù)51RFLP的原理利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，構(gòu)成大小不等、數(shù)量不同的分子片段，經(jīng)電泳分別，經(jīng)過Southern印跡將DNA片段轉(zhuǎn)移至支持膜(尼龍膜或硝酸纖維素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素(如地高辛，熒光素)標(biāo)志的探針與支持膜上的DNA片段進展雜交。不同基因組DNA酶切位點的改動，會使得RFLP譜帶表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性.52RFLP表示圖限制性片段的制備電泳Southern印跡與放射性探針雜交放射性自顯影53RFLP的特點呈共顯性遺傳、無表型效應(yīng)、不受年齡性別的影響等優(yōu)點。分析一次只能檢測1個位點，多態(tài)信息含量較低，而且操作復(fù)雜，耗時費力，本錢高，并且對模板DNA需求量大。54PCR－RFLP將PCR技術(shù)用于RFLP分析，即PCR-RFLP。該技術(shù)先用1對引物特異性擴增基因組的某一高變區(qū)，然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測多態(tài)性。PCR-RFLP分析省去了探針的制備、分子雜交等繁瑣的過程，DNA需求量也少，大大簡化了傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)。55PCR－RFLP的運用??????CCTGAGGAG????????????CCTGTGGAG????????????CCTGAGGAG????????????CCTGAGGAG????????????CCTGTGGAG????????????CCTGTGGAG??????√MstⅡ酶切位點×MstⅡ酶切位點消逝PCR-RFLPProValGluProGluGlu123正常雜合異常562、串聯(lián)反復(fù)序列標(biāo)志tandemrepeatedsequence,TRS真核生物基因組中的可變串聯(lián)反復(fù)序列〔variablenumbertandemrepeatedsequence,VNTR〕有兩類:小衛(wèi)星和微衛(wèi)星，兩者具有高度的變異性。57(1)小衛(wèi)星(minisatelliteDNA)小衛(wèi)星反復(fù)單位的中心序列為15一76bp近緣物種和個體間的小衛(wèi)星中心序列有著一定的同源性，在一定的條件下可以相互雜交。58DNA指紋圖譜原理①選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點的限制性內(nèi)切酶將動物總基因組DNA切成不同長度的片段②以VNTR中特異序列作為探針，進展Southern雜交，③由于不同個體的串聯(lián)反復(fù)序列的數(shù)目和位置不同，構(gòu)成的雜交譜帶具有個體的特異性，人們稱為DNA指紋圖譜(DNAfingerprinting,DFP)59VNTR表示圖123ABC123VNTR變異的原理表示圖6061DFP的特點多態(tài)性檢測率高，位點呈共顯性遺傳個體具有高度特異性技術(shù)復(fù)雜、本錢高，有時譜帶過于復(fù)雜62⑵微衛(wèi)星〔microsatelliteDNA,MS)又稱簡單序列反復(fù)(simplesequencerepeat,SSR)是高度反復(fù)序列，廣泛存在于真核生物基因組，反復(fù)單位的中心序列為2~6bp。63微衛(wèi)星遺傳標(biāo)志的原理以微衛(wèi)星DNA標(biāo)志兩側(cè)特異性序列設(shè)計專注引物，經(jīng)過PCR技術(shù)擴增微衛(wèi)星片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯