第二章-沉淀法

第二章沉淀法

沉淀法（溶解度法）—是純化生物大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法

優(yōu)點：操作簡單，成本低廉

分類：鹽析沉淀

有機溶劑沉淀

選擇性沉淀第一節(jié)基本原理原理：根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性（如蛋白質(zhì)分子表面疏水性基團和親水基團之間的差異性）來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)（如pH、極性、離子強度、金屬離子等），進而導(dǎo)致有效成分的溶解度發(fā)生變化。

一、鹽析法原理：是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出（鹽析）。原因：鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。第二節(jié)沉淀的類型與操作一般操作步驟（蛋白質(zhì)分級沉淀時常用）1）選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25％飽和度硫酸銨），使部分雜質(zhì)呈“鹽析”（沉淀）狀態(tài)，有效成分呈“鹽溶”（溶解）狀態(tài)。2)經(jīng)離心后得到上清液，再選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如25％-60％飽和度的鹽溶液），使有效成分等物質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而另一部分雜質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，用離心法收集的沉淀物即為初步純化的有效成分物質(zhì)。

1.鹽的分級沉淀（1）鹽類的選擇

常選用：硫酸銨

優(yōu)點：

a.溶解度大，對溫度不敏感，當(dāng)水溫25℃時，硫酸銨的飽和溶解度（即每升溶劑可溶解鹽的克數(shù)）為769克。當(dāng)水的溫為0℃時，其飽和溶解度679克。

b.分級效果好，有些抽提液經(jīng)過加入適量硫酸銨的一次性可除雜蛋白75%以上

c.有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，將2-3mol/L硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)置低溫下保存一年，其性質(zhì)沒有變化

d.價格低廉，廢液可肥田

缺點：即得到的樣品欲繼續(xù)純化時，需花一定時間脫鹽（2）硫酸銨鹽析的操作①固體加入法：在溶液中逐步加入固體硫酸銨，加到一定飽和度時，蛋白質(zhì)可沉淀出來。

注意：控制加入的速度，在攪拌下、以少量多次方式緩慢地加入，待先加的硫酸銨溶解后再加入少量的硫酸銨。②飽和溶液加入法是使蛋白質(zhì)脫水沉淀比較溫和的方法蛋白質(zhì)溶液中逐步加入預(yù)先調(diào)好pH的飽和硫酸銨溶液，不同飽和度所需的硫酸銨量可用計算：

V＝需加入硫酸銨溶液的體積（毫升）；V0＝原來溶劑的體積（毫升）；S1＝原來溶液的百分飽和度；S2＝要求達到的百分飽和度；S3＝需要加入硫酸銨溶液的飽和度（一般用100%的）。優(yōu)點：比加入固體硫酸銨沉淀法溫和。缺點：對于大體積樣品不適用。因為硫酸銨溶液的大量加入，將導(dǎo)致樣品溶液體積增加。③透析鹽析法

將盛蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度。

特點：鹽濃度是以連續(xù)的狀態(tài)變化，可以避免鹽濃度局部升高產(chǎn)生的不良影響，分離效果好。

缺點：只用于要求較精確、樣品體積小的試驗。2．鹽析曲線的制作用鹽析法沉淀欲分離樣品時所需鹽濃度范圍要通過實驗確定。具體步驟：取一定體積已測含量的蛋白質(zhì)或酶待分離溶液，調(diào)節(jié)pH至穩(wěn)定范圍，分6-10次加入不同量的硫酸銨：第一次加硫酸銨到溶液出現(xiàn)微弱混濁狀態(tài)時，靜置一段時間，離心或過濾即得到第一個分級沉淀部分。接著以同樣的操作加硫酸銨到上清液或過濾液中，則得到第二個分級沉淀部分。如此連續(xù)進行，便可得到6-10個分級沉淀部分。然后將每個分級沉淀部分分別重新溶解于一定體積的適宜pH的緩沖液中，根據(jù)其蛋白質(zhì)或酶含量和相對應(yīng)的硫酸銨濃度之間的關(guān)系作圖，即可得到典型鹽析曲線。在此曲線基礎(chǔ)上，參照分級試驗方法，可找出有利于提高收得率和純化倍數(shù)的精細(xì)鹽析范圍。

3.鹽析的影響因子（1）鹽析常數(shù)（Ka）蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度的關(guān)系為：溶解度（S，以mg/ml表示）的對數(shù)值與溶液中鹽的濃度（M）成反比例關(guān)系，可用公式表示：

lgS＝β-Ka·M式中β表示有效成分在水中溶解度的對數(shù)值；M表示克分子濃度；Ka表示有效成分在特定條件下的數(shù)值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是隨著鹽濃度的增加而增加的。

Ka值大，則意味著有效成分溶解度降低的速率快。因此，對一種有效成分而言，Ka值越大，分級范圍越窄。鹽析效果就越好。

某一蛋白質(zhì)的Ka值：

與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)

與溶液的pH、溫度和鹽的種類等有關(guān)(2)鹽的分級范圍的差異性

當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時，若每一種蛋白質(zhì)的Ka值都很大，而且鹽析范圍（鹽離子強度）差異明顯，則分離效果好；若Ka值很大，但鹽析范圍差異較小，則分離效果不好。(3)pH和鹽濃度溶解度與pH和鹽濃度有密切關(guān)系。當(dāng)這兩種因子變動時，溶解度將發(fā)生明顯的變化。選擇適當(dāng)pH的鹽溶液，可提高對有效成分的鹽析效果。另外，硫酸銨水溶液顯酸性，為防止其對某些蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)及時用氨水調(diào)pH至中性或視有效成分的pH而定。(4)蛋白質(zhì)的純度和濃度蛋白質(zhì)存在的形式和濃度不同，鹽析范圍和溶解度也不同。在混合的蛋白質(zhì)溶液中，不同分子間的相互作用會發(fā)生共沉淀現(xiàn)象。蛋白濃度越高，這種現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差。因此，一般控制樣品液蛋白濃度在0.2％-2％為宜。(5)其它在溶液中加1mmo1/L的EDTA-Na2鹽，以除去沉淀劑中帶入的金屬離子?；蚩刂萍恿蛩徜@沉淀的時間，一般二小時左右。4．脫鹽常用方法：凝膠過濾法和透析法具體操作：是把待脫鹽溶液裝入有一定孔徑的透析袋，扎緊袋口（袋內(nèi)留適當(dāng)?shù)目臻g）。漂在水或適當(dāng)?shù)耐肝鲆褐?。要防止透析液從袋口進入，以免引起透析袋脹裂。鹽離子和小分子物質(zhì)將穿過半透膜由高向低進行擴散滲透，而蛋白質(zhì)等則留在袋內(nèi)。不斷更新透析液，若用溫和攪動的辦法則效果較好；為了避免蛋白質(zhì)或酶類破壞，在低溫下進行。透析時注意：（1）透析袋的處理新的透析袋用蒸餾水洗凈，無漏洞時，即可使用。除去透析袋中所含鹽類時，處理方法：將透析袋置500毫升含1mmo1/LEDTA-Na2的2％碳酸氫鈉溶液中煮沸10分鐘，用干凈鑷子或戴橡皮手套取出，蒸餾水煮沸、漂洗后，可使用。用過的透析袋同樣處理后，能重復(fù)使用。

保存：泡在蒸餾水中置低溫（4℃）或泡在70％的乙醇中保存。（2）選用適當(dāng)?shù)耐肝鲆?/p>

一般選用：低離子強度的中性緩沖液

對含有輔基的酶透析時，在透析液中宜加入適量的輔基或保護輔基的試劑。

為了防止微生物生長，透析應(yīng)在4℃進行或在透析液中添加0.02％疊氮化鈉。(3)掌握透析時間

攪拌下進行，樣品液與透析液體積之比以1:10較好，一般三小時。

在靜止?fàn)顟B(tài)下過夜進行時，則比例應(yīng)擴大到1:20以上。鹽脫是否徹底，要經(jīng)常檢查：除去硫酸銨，可用10%氯化鋇檢查除去氯化鈉，可用10％硝酸銀檢查透析液中檢測不出現(xiàn)硫酸鋇或氯化銀沉淀，即透析完成。二、有機溶劑沉淀法有機溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因：

（1）與鹽溶液一樣具有脫水作用（2）有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小

常用的有機溶劑：甲醇、乙醇和丙酮用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)，需加入的有機溶劑量，一般以體積為單位計算：

V＝需加入有機溶劑的體積V0＝蛋白溶液的原始體積S1＝蛋白溶液中有機溶劑的濃度(體積百分濃度)S2＝蛋白溶液中欲達到的溶劑濃度(體積百分濃度)如果使用的有機溶劑含量不是100％而是95%，則公式中的100應(yīng)改95，余此類推。需要指出：（1）低溫下操作

由于有機溶劑加入水溶液時產(chǎn)生放熱反應(yīng)會引起蛋白質(zhì)變性

有機溶劑預(yù)冷至-10℃，在低溫下進行（2）中性鹽的作用

少量的中性鹽能增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，降低有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，提高分級效果。

若加入過多，可引起蛋白質(zhì)析出，影響有機溶劑的分級作用。

中性鹽的離子強度在0.05以下時，能防止蛋白質(zhì)變性。用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時，宜在稀鹽溶液或低濃度緩沖液中進行。（3）多價陽離子的作用

蛋白質(zhì)和多價陽離子（如Zn2+和Cu2+等）能結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度降低。這對在高濃度溶劑中才能沉淀的蛋白質(zhì)特別有益。

例如，在某些蛋白質(zhì)溶液中只要加入0.005-0.02nmol/LZn2+，就可大大減少有機溶劑的用量，而將蛋白質(zhì)沉淀出來。三、蛋白質(zhì)沉淀劑

堿性蛋白質(zhì)

多價陽離子的堿性蛋白質(zhì)，如魚精蛋白，除能有效地沉淀核酸類物質(zhì)外，還能沉淀某些蛋白質(zhì)。缺點：（1）反應(yīng)不可逆，應(yīng)用受到限制（2）在應(yīng)用多價陽離子物質(zhì)時，因其水溶液

pH值為2-3，所以要小心地中和后，再加到蛋白質(zhì)溶液中2．凝集素

植物中特殊的蛋白質(zhì)，對糖蛋白中糖鏈的末端糖序列具有明顯、特異的凝集力。

例如，伴刀豆球蛋白與含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異的凝集沉淀作用，通過離心操作可把糖蛋白和一般蛋白質(zhì)分開，獲得的凝集素-糖蛋白復(fù)合物用單糖作抑制劑就能使其解離。

優(yōu)點：反應(yīng)條件較溫和，專一性強3．重金屬

重金屬鹽如鉛鹽、汞鹽作為蛋白質(zhì)沉淀劑能使蛋白質(zhì)或酶純化。

重金屬會使蛋白質(zhì)變性，因此控制在較溫和的條件下進行，并要及時通過透析方法把蛋白質(zhì)和重金屬盡快分開。

四、聚乙二醇沉淀作用水溶性非離子型聚合物，可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。沉淀作用較滿意的聚合物是分子量在400-6000之間的聚乙二醇。優(yōu)點：條件溫和，不易引起蛋白質(zhì)變性，沉淀較完全，應(yīng)用范圍廣。缺點：易受各種因子