東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因Mf-HSP90α的克隆篩選及其功能研究

東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因Mf-HSP90α的克隆篩選及其功能研究流行病學(xué)調(diào)查及人工感染實(shí)驗(yàn)研究證明東方田鼠具有天然的日本血吸蟲抗性,這種抗性能夠穩(wěn)定遺傳?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)理論認(rèn)為,生物體對(duì)于任何疾病的易感性和抗性都可能是由相應(yīng)基因所決定的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠體內(nèi)不同組織及組分體外抗日本血吸蟲抗性最強(qiáng)的是血清,被動(dòng)轉(zhuǎn)移血清的小鼠同樣獲得日本血吸蟲抗性。從東方田鼠血清入手,篩選分離抗日本血吸蟲抗性物質(zhì)成為有效防治日本血吸蟲病新的突破口。本研究從東方田鼠骨髓基因表達(dá)文庫(kù)入手,應(yīng)用表達(dá)克隆法逐級(jí)篩選,最終獲得日本血吸蟲抗性基因Mf-HSP90α,生物信息學(xué)分析其結(jié)構(gòu)和功能后,制備條件培養(yǎng)基,驗(yàn)證基因表達(dá)產(chǎn)物的體外殺傷日本血吸蟲童蟲效果,并使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN,構(gòu)建重組pLXSN-HSP90α質(zhì)粒,包裝重組基因病毒,導(dǎo)入日本血吸蟲感染小鼠體內(nèi),驗(yàn)證其體內(nèi)抗蟲效果。一、東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因gC14.75的克隆篩選本研究構(gòu)建了東方田鼠骨髓基因表達(dá)文庫(kù),根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的體外殺日本血吸蟲童蟲活性應(yīng)用表達(dá)克隆法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選：基因表達(dá)文庫(kù)隨機(jī)分成8個(gè)基因池,相應(yīng)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集48h轉(zhuǎn)染上清(條件培養(yǎng)基),進(jìn)行體外殺日本血吸蟲童蟲實(shí)驗(yàn),設(shè)立陰性對(duì)照：pcDNA1.1/Amp空載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)上清；陽(yáng)性對(duì)照：20%東方田鼠血清。條件培養(yǎng)基殺蟲率最高的基因池進(jìn)入下一輪篩選,三輪篩選后獲得殺蟲效果最好的次級(jí)亞基因池gC14。gCl4質(zhì)粒鋪瓊脂糖平板,隨機(jī)挑取單個(gè)克隆,根據(jù)單克隆插入片段大小的不同,挑選32個(gè)進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物殺蟲實(shí)驗(yàn),最終獲得體外殺蟲效果最好的單個(gè)克隆gC14.75。基因池條件培養(yǎng)基體外殺童蟲率最高一組為gC,童蟲死亡率為10.9%,與對(duì)照組相比P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。亞基因池gC1、次級(jí)亞基因池gC14條件培養(yǎng)基的殺蟲率分別為11.5%、15.9%,與對(duì)照組相比P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單克隆篩選中體外殺蟲率最高的克隆是75號(hào),殺蟲率為11.0%。將克隆質(zhì)粒DNA送Invitrogen公司測(cè)序獲得抗性基因EST,長(zhǎng)度為331bp,將其命名為gC14.75。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)gC14.75為HSP90α的同源序列。二、gC14.75基因全長(zhǎng)的克隆及其功能分析HSP90是一個(gè)高度保守的基因家族。以gC14.75序列及與其同源性最高的中國(guó)倉(cāng)鼠全長(zhǎng)HSP90αcDNA(L33676)序列為模板,分別設(shè)計(jì)引物,RT-PCR擴(kuò)增獲得gC14.75全長(zhǎng)序列。將全長(zhǎng)序列測(cè)序后,用NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTN進(jìn)行序列比對(duì)分析,結(jié)果顯示該基因與HSP90α同源,故將其命名為Mf-HSP90α。進(jìn)而通過生物信息學(xué)方法分析該基因結(jié)構(gòu)及功能。比對(duì)分析幾種不同物種HSP90α的核苷酸及氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)氨基酸、核苷酸序列差異很小。為了尋找可能存在的抗日本血吸蟲功能差異的依據(jù),我們用3D-JIGSAW(version2.0)分析比較了東方田鼠與小鼠氨基酸序列的立體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示二者在立體結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。分別將Mf-HSP90α及小鼠HSP90α(Ms-HSP90α)重組到真核表達(dá)載體pcDNA1.1/Amp,制備相應(yīng)條件培養(yǎng)基,進(jìn)行體外殺日本血吸蟲童蟲實(shí)驗(yàn)?？鄢瞻讓?duì)照組童蟲死亡率,Mf-HSP90α條件培養(yǎng)基殺蟲率為20.3%,與對(duì)照組相比較殺蟲效果顯著,而Ms-HSP90α條件培養(yǎng)基殺蟲率僅為4.4%,與Mf-HSP90α相比較存在顯著差異。為了進(jìn)一步探討東方田鼠與小鼠HSP90α抗蟲功能差異的機(jī)制。我們進(jìn)一步從mRNA、蛋白質(zhì)水平分別用RT-PCR、Western-blot方法比較分析了HSP90α在東方田鼠及小鼠體內(nèi)不同組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)同一物種體內(nèi)不同組織間HSP90α的表達(dá)存在顯著差異,同一種組織在東方田鼠與小鼠間的表達(dá)情況也明顯不同。三、小鼠體內(nèi)Mf-HSP90α的抗日本血吸蟲作用及表達(dá)情況分析為了進(jìn)一步確認(rèn)Mf-HSP90α的抗日本血吸蟲活性,我們采用了基因轉(zhuǎn)移技術(shù),將該基因?qū)胙x易感動(dòng)物(小鼠)體內(nèi),通過對(duì)小鼠模型的抗日本血吸蟲效果的考察評(píng)估Mf-HSP90α的體內(nèi)抗蟲作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN,構(gòu)建pLXSN-HSP90α重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng),通過小鼠尾靜脈注射將重組病毒導(dǎo)入小鼠體內(nèi),檢測(cè)重組病毒治療后感染小鼠的減蟲率、肝臟減卵率、血吸蟲蟲體改變及小鼠肝臟肉芽腫減少情況。重組病毒載體經(jīng)PA317細(xì)胞包裝后,大量收集病毒懸液,經(jīng)生物學(xué)方法檢測(cè)病毒滴度：pLXSN病毒滴度為1.6×107cfu/mlpLXSN-HSP90α病毒滴度為4×106cfu/ml。分別用pLXSN、pLXSN-HSP90α病毒各200μl／次,共3次經(jīng)尾靜脈注射治療日本血吸蟲感染小鼠,空白對(duì)照組注射等體積DMEM。pLXSN-HSP90α重組病毒處理組檢獲成蟲相比DMEM及pLXSN病毒組均要短小,檢獲成蟲數(shù)也明顯少于兩對(duì)照組,減蟲率與DMEM及pLXSN病毒組相比較分別是40.8%和32.3%。選取具有代表性肝臟制成石蠟切片,進(jìn)行HE染色,鏡下可以觀察到pLXSN-HSP90α重組病毒處理組蟲卵肉芽腫明顯少于兩對(duì)照組,與肉眼觀察肝臟表面結(jié)果相同。pLXSN-HSP90α重組病毒處理組LEPG與DMEM及pLXSN病毒組相比,pLXSN-HSP90α重組病毒處理組的減卵率分別是57.9%和49.2%。減蟲率、減卵率DMEM與pLXSN病毒組相比P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,pLXSN-HSP90α重組逆轉(zhuǎn)錄病毒組與DMEM及pLXSN病毒相比P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了探討Mf-HSP90α抗日本血吸蟲功能的機(jī)制,我們用RT-PCR的方法分析比較了感染尾蚴7天DMEM,pLXSN-HSP90α重組逆轉(zhuǎn)錄病毒不同處理組小鼠體內(nèi)幾種組織HSP90α表達(dá)情況,通過對(duì)RT-PCR條帶灰度掃描,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)DMEM處理組小鼠肌肉HSP90α的表達(dá)豐度很低,其他組織表達(dá)豐度適中,組織間差異不大。pLXSN-HSP90α重組逆轉(zhuǎn)錄病毒處理組小鼠肺、腦、骨髓3種組織HSP90α的表達(dá)豐度相比其他幾種組織明顯要高,也明顯高于與DMEM處理組肺、腦及骨髓的表達(dá)豐度也明顯要高。綜上所述,本研究應(yīng)用表達(dá)克隆法從東方田鼠骨髓基因表達(dá)文庫(kù)篩選到一個(gè)日本血吸蟲抗性相關(guān)基因Mf-H