多不飽和脂肪酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制的研究

多不飽和脂肪酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制的研究前列腺癌(prostiticcancer)是男性癌癥患者的主要死亡原因之一,嚴(yán)重危害男性生活質(zhì)量和生命健康。目前,臨床上對(duì)于前列腺癌癥患者的診斷和治療,仍缺乏更為科學(xué)有效的方法。臨床上對(duì)前列腺癌癥患者的診斷,主要依靠癌組織病理形態(tài)學(xué)的Gleason分級(jí)評(píng)分,作為判斷前列腺癌癥患者,實(shí)施何種治療方案和推測(cè)其預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)。另外,前列腺癌的病理學(xué)改變復(fù)雜,準(zhǔn)確鑒別并分級(jí)難度較大。因此,復(fù)合ELISA等方法,也是前列腺癌的輔助診斷依據(jù)。近期研究表明,前列腺的原生腺體組織和周?chē)g質(zhì)組織,在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用?；叶褥鼐仃?GLEM)紋理分析是一種新的圖像分析,用來(lái)評(píng)價(jià)和研究胞外間質(zhì)取向的變化,有其獨(dú)特的優(yōu)越性。能否利用GLEM輔助分期分型診斷前列腺癌是本研究的內(nèi)容之一。目前,臨床上預(yù)防和治療前列腺癌,傳統(tǒng)的治療方案就是雄激素剝奪治療(androgendepritiontreatment,ADT),包括藥物抗雄激素以及手術(shù)去勢(shì),以阻止雄激素結(jié)合到雄激素受體上的方式,抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這一方案至今仍是前列腺癌的主要治療手段。然而,傳統(tǒng)的抗雄治療,并不能完全抑制前列腺癌的進(jìn)程,大多數(shù)前列腺癌癥患者,在經(jīng)過(guò)ADT治療之后,都會(huì)以非激素依賴的方式復(fù)發(fā)。深海魚(yú)油,其主要成分是n-3系多不飽和脂肪酸(n-3Polyunsaturatedfattyacids,n-3PUFA)中的DHA(docosahexaenoicacid;C22:6n-3)和EPA(eicosapentaenoicacid;C20:5n-3)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)人群調(diào)查和meta分析表明,飲食中增加n-3PUFA的攝入,有可能降低前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。那么,n-3系多不飽和脂肪酸,在細(xì)胞水平能否直接影響前列腺癌細(xì)胞,發(fā)揮抗癌的作用呢?為了解決上述問(wèn)題,本研究以臨床前列腺癌癥患者和前列腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象,進(jìn)行以下三部分研究:1)對(duì)比復(fù)合ELISA方法,利用GLEM紋理分析方法,檢測(cè)患者的前列腺腺癌反應(yīng)性間質(zhì)和轉(zhuǎn)移潛能;2)利用n-3系多不飽和脂肪酸處理前列腺癌細(xì)胞,觀察何種n-3PUFA能夠影響前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng);3)n-3系多不飽和脂肪酸DHA如何改變基因表達(dá),促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。通過(guò)上述三個(gè)部分的研究,為臨床輔助分期分型診斷前列腺癌,飲食補(bǔ)充n-3pufa預(yù)防和治療前列腺癌,提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。第一部分灰度熵矩陣法glem在臨床檢測(cè)高級(jí)別前列腺腺癌反應(yīng)性間質(zhì)和轉(zhuǎn)移潛能的可行性分析目的:對(duì)比研究復(fù)合elisa和灰度熵矩陣(glem)紋理分析,評(píng)價(jià)能否通過(guò)glem判斷前列腺癌細(xì)胞外間質(zhì)取向的變化(即反應(yīng)性間質(zhì))和轉(zhuǎn)移潛能。方法:1收集前列腺癌癥患者的標(biāo)本,觀察病理改變并進(jìn)行核密度分析。2灰度熵矩陣glem對(duì)樣本進(jìn)行紋理分析。3利用復(fù)合elisa方法綜合評(píng)價(jià)各前列腺癌組織樣本。結(jié)果:1組織形態(tài)學(xué)和核密度分析he染色可見(jiàn)良性前列腺增生(bph),是以基底細(xì)胞的增生肥大為主要特點(diǎn),基底細(xì)胞多為立方形和矮柱狀,平滑肌細(xì)胞粗大、密集,彌散地分布于間質(zhì)中,細(xì)胞核形態(tài)未有明顯異常變化;與bph相比,晚期前列腺腺癌(pa)的基底細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常紊亂,細(xì)胞核深染、顆粒數(shù)量增多但大小不一,與核密度分析顯示的結(jié)果一致(p<0.05)。2灰度熵矩陣glem紋理分析利用專業(yè)圖像處理軟件,突出了間質(zhì)組織的信號(hào),可見(jiàn)bph的間質(zhì)所占比例較高,間質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分發(fā)生變化,平滑肌占間質(zhì)的面積增加;與bph相比,晚期pa和治療不敏感pa的間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)紊亂,間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)各異。進(jìn)一步分析顯示,與正常前列腺和bph相比,晚期pa和治療不敏感pa的相鄰像素間,對(duì)比度(neighboringpixelscontrast)缺失明顯,同樣提示間質(zhì)細(xì)胞排列紊亂,間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)異常?；叶褥鼐仃噂lem紋理分析結(jié)果表明,各種前列腺樣本的紋理參數(shù)即異質(zhì)性缺失(lossofheterogeneity)的差異,較相鄰像素間對(duì)比度更為明顯。高度紊亂的基質(zhì)結(jié)構(gòu),往往提示著惡性分級(jí)更高的前列腺腫瘤。在各樣本中,良性前列腺增生樣本的熵值最低(p<0.05),而非雄激素依賴性前列腺癌組織樣本的熵值最高(p<0.05),熵值的高低代表了圖像中反應(yīng)性基質(zhì)的多少。3復(fù)合elisa分析用復(fù)合elisa方法,將各個(gè)血清前列腺癌特異抗原(其中vegf代表新生血管基因,beta1-integrin、e-cadherin和mmp3代表e-m轉(zhuǎn)換相關(guān)基因,rankl和osteoprotegerin代表惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因)的檢測(cè)結(jié)果,進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),各癌性前列腺組織樣本與良性前列腺增生樣本單獨(dú)進(jìn)行比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;將五種樣本一起比較分析后,其組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:復(fù)合elisa方法僅能判斷前列腺組織樣本的良、惡性,不能進(jìn)一步輔助前列腺癌的分期分級(jí)。灰度熵矩陣glem紋理分析,可以通過(guò)熵值分析間接反映前列腺癌組織反應(yīng)性基質(zhì)的數(shù)量,可輔助前列腺疾病的診斷和分期分級(jí)。第二部分多不飽和脂肪酸pufa對(duì)前列腺癌細(xì)胞的促凋亡作用目的:檢測(cè)深海魚(yú)油、n-3pufa中的epa和dha、n-6pufa中的花生四烯酸(aa),對(duì)良性前列腺細(xì)胞和不同前列腺癌細(xì)胞的影響,在細(xì)胞水平研究哪些pufa能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),為臨床應(yīng)用pufa預(yù)防和治療前列腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1采用mtt方法,檢測(cè)fishoil、epa、dha和aa對(duì)前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞生存率的影響。2應(yīng)用westernblot和rtreal-timepcr,檢測(cè)caspase3的基因表達(dá)水平。3通過(guò)hochest33258染色,觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核改變。結(jié)果:1深海魚(yú)油fishoil降低前列腺癌細(xì)胞的生存率與bsa對(duì)照組相比,不同濃度f(wàn)ishoil刺激pcs-440-010良性前列腺細(xì)胞24小時(shí)后,沒(méi)有影響其生存率;不同濃度f(wàn)ishoil刺激pc3和du145前列腺癌細(xì)胞24小時(shí)后,兩種癌細(xì)胞生存率明顯下降(p<0.05);不同濃度f(wàn)ishoil刺激lncap前列腺癌細(xì)胞24小時(shí)后,沒(méi)有影響其生存率。2epa、dha和aa對(duì)前列腺癌細(xì)胞生存率的影響分別給予n-3pufa中的epa和dha刺激24小時(shí),均可以明顯降低pc3和du145前列腺癌細(xì)胞的生存率(p<0.05)。給予不同濃度的n-6系多不飽和脂肪酸aa刺激24小時(shí),對(duì)du145前列腺癌細(xì)胞的生存率沒(méi)有影響。給予dha50μm分別刺激du145前列腺癌細(xì)胞12,24,48,72小時(shí)后發(fā)現(xiàn),du145生存率與dha刺激呈時(shí)間依賴性。3dha促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞du145的caspase3表達(dá)并誘發(fā)細(xì)胞凋亡與bsa對(duì)照組相比,不同濃度dha刺激前列腺癌細(xì)胞du14524小時(shí)后發(fā)現(xiàn),caspase3的mrna水平明顯增高,呈濃度依賴性(p<0.05);不同濃度dha刺激前列腺癌細(xì)胞du14524小時(shí)后發(fā)現(xiàn),caspase3的蛋白質(zhì)水平明顯增高;hochest33258染色結(jié)果顯示,dha50μm處理du145前列腺癌細(xì)胞24小時(shí)后,可見(jiàn)細(xì)胞核染色變深,且多處細(xì)胞核呈碎塊狀且致密濃染。結(jié)論:深海魚(yú)油能夠降低前列腺癌細(xì)胞的生存率,然而,對(duì)良性前列腺細(xì)胞無(wú)此影響。n-3系多不飽和脂肪酸dha能夠呈濃度、時(shí)間依賴性降低前列腺癌細(xì)胞du145的生存率。dha通過(guò)誘導(dǎo)caspase3表達(dá)增加,導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞du145發(fā)生凋亡,降低其生存率。第三部分dha誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路研究目的:利用能夠同時(shí)檢測(cè)84個(gè)凋亡通路相關(guān)基因的rt2profilerpcrarrays方法,進(jìn)一步用定量pcr進(jìn)行驗(yàn)證,探索dha如何改變凋亡信號(hào)通路,引起前列腺癌細(xì)胞凋亡,為臨床應(yīng)用dha防治前列腺癌,提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法:1利用rt2profilerarray-apoptosis方法,尋找dha誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)。2利用rtreal-timepcr方法,驗(yàn)證和篩選結(jié)果。結(jié)果:1dha引起前列腺癌細(xì)胞du145凋亡信號(hào)通路的激活1.1rt2profilerarray方法篩選結(jié)果應(yīng)用rt2profilerarray-apoptosis方法,對(duì)84個(gè)凋亡相關(guān)基因mrna水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,dha50μm處理du145前列腺癌細(xì)胞24小時(shí)后,凋亡信號(hào)通路中共有10個(gè)基因表達(dá)上調(diào)且大于等于2倍,5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)且小于等于0.5倍。與bsa處理的對(duì)照組相比,dha處理24小時(shí)后,du145細(xì)胞caspase家族中的caspase1,caspase3和caspase9轉(zhuǎn)錄水平,分別上調(diào)了2.06,4.88和12.10倍;促細(xì)胞凋亡的bax基因上調(diào)了2.93倍,并且bax與bcl2比值增加;細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)基因cidea和dffa,分別上調(diào)了2.34和3.21倍;腫瘤壞死因子相關(guān)基因lta和tnf,分別上調(diào)了2.04和2.24倍;基因警察tp53的mrna表達(dá)上調(diào)了2.97倍。另外,與bsa處理的對(duì)照組相比,dha處理24小時(shí)后,du145細(xì)胞線粒體相關(guān)凋亡誘導(dǎo)基因aifm1,蛋白激酶akt1,bh3位點(diǎn)死亡誘導(dǎo)基因bid和birc6,x連鎖凋亡抑制蛋白xiap轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),均發(fā)生下調(diào)。1.2rtreal-timepcr方法驗(yàn)證和篩選結(jié)果不同濃度dha刺激24小時(shí)后,在前列腺癌du145細(xì)胞caspase家族中,caspase1、caspase3、caspase9和caspase12,表達(dá)均明顯增加,其中caspase3、caspase9和caspase12的表達(dá),與dha刺激濃度有劑量依賴性關(guān)系;前列腺癌du145細(xì)胞bax、cidea、dffa、tnf和tp53基因表達(dá),均明顯增加;其中bax、cidea和tnf的表達(dá),與dha刺激濃度有劑量依賴性關(guān)系;前列腺癌du145細(xì)胞aifm1、akt1、bid、birc6和xiap基因表達(dá),均明顯下降;其中aifm1、bid和xiap的表達(dá),與dha刺激濃度