丙泊酚通過(guò)miR-133a-5pMAPK6對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

丙泊酚通過(guò)miR-133a-5p/MAPK6對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究研究背景:肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是肝臟手術(shù)常見(jiàn)的生理變化,大量研究證實(shí),肝臟I/R損傷是肝臟手術(shù)后肝臟功能低下、肝淤血、進(jìn)行性血栓形成及移植物無(wú)功能等并發(fā)癥的主要原因。同時(shí),由于缺氧/復(fù)氧過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)活性氧的形成、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化等嚴(yán)重?fù)p害肝細(xì)胞,繼而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生乃至細(xì)胞的凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn),在肝臟手術(shù)后,由肝臟I/R造成的死亡率明顯上升,然而由于其復(fù)雜的生理生化過(guò)程,目前尚無(wú)統(tǒng)一有效的預(yù)防和治療方法。因此,尋找合適的藥物,有效控制肝臟I/R損傷是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的一大熱點(diǎn)和難點(diǎn)。丙泊酚(Propofol)是一種新型快速短效的靜脈麻醉藥,其臨床特點(diǎn)是起效快、持續(xù)時(shí)間短、蘇醒迅速而平穩(wěn),不良反應(yīng)少,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床各科手術(shù)麻醉。近年來(lái),越來(lái)越多的研究證明丙泊酚在肝臟I/R損傷中起到保護(hù)作用,然而其具體保護(hù)機(jī)制尚未闡明。有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族,其級(jí)聯(lián)反應(yīng)是通過(guò)改變蛋白質(zhì)的磷酸化水平將信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi),并向下游傳遞。MAPKs參與機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),其通過(guò)將受體接受的胞外信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,參與調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等一系列生理過(guò)程。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明,MAPK信號(hào)通路參與機(jī)體內(nèi)一系列I/R過(guò)程,并且可能引起組織器官結(jié)構(gòu)和功能的改變。有絲分裂原激活蛋白激酶6(mitogen-activatedproteinkinase6,MAPK6)是MAPK家族的重要成員之一,其表達(dá)上調(diào)顯著增加細(xì)胞的凋亡,參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。然而,MAPK6在肝臟I/R中的作用待進(jìn)一步研究。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA,長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸。MiRNA在生物進(jìn)化中比較保守,從低等生物如細(xì)菌,病毒等到動(dòng)植物的基因組中均有存在。研究證實(shí),miRNA廣泛參與基因的表達(dá)調(diào)節(jié),及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等重要的生命活動(dòng),是生物體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)手段。已有研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與肝臟I/R損傷,其中miR-133a被證實(shí)是一個(gè)與I/R損傷密切相關(guān)的miRNA。MiR-133a可以通過(guò)靶向調(diào)控死亡相關(guān)蛋白激酶2(deathassociatedproteinkinase2,DAPK2)進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮對(duì)I/R心肌的保護(hù)作用。同時(shí),miR-133a-5p也被證實(shí)可通過(guò)靶向調(diào)控DAPK2蛋白抑制I/R引起的心肌細(xì)胞凋亡。此外,miR-133a-5p還可通過(guò)靶向FSCN1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移,增加肝癌細(xì)胞凋亡。然而,miR-133a-5p在肝臟I/R損傷中的作用尚未闡明。本文通過(guò)通過(guò)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-133a-5p與MAPK63’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn),表明MAPK6可能是miR-133a-5p的下游調(diào)控靶分子之一。基于以上背景,本研究首先丙泊酚預(yù)處理待建模型大鼠,然后建立肝臟I/R大鼠模型,利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝臟損傷標(biāo)記物水平,同時(shí)利用qRT-PCR和westernblot進(jìn)一步檢測(cè)病大鼠肝臟組織中MAPK6和miR-133a-5P的表達(dá);其次建立肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,進(jìn)一步探討丙泊酚在肝臟細(xì)胞H/R損傷保護(hù)中的分子機(jī)制;最后通過(guò)大鼠肝臟I/R在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證丙泊酚在肝臟I/R損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。本文旨在進(jìn)一步闡釋丙泊酚對(duì)肝臟I/R損傷的保護(hù)作用機(jī)制,為丙泊酚的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。研究?jī)?nèi)容分為3部分:第一部分:丙泊酚在大鼠肝臟I/R損傷中的保護(hù)作用及其對(duì)miR-133a-5p和MAPK6表達(dá)的影響目的:觀察丙泊酚對(duì)大鼠肝臟I/R損傷的保護(hù)效應(yīng)及其對(duì)miR-133a-5p和MAPK6表達(dá)的調(diào)控。方法:1.丙泊酚預(yù)處理大鼠,構(gòu)建大鼠肝臟I/R損傷模型,收集假手術(shù)組、I/R組和丙泊酚干預(yù)組大鼠血清,全自動(dòng)生化分析儀直接檢測(cè)血清中AST和ALT的水平。2.處死所有實(shí)驗(yàn)大鼠,取肝臟組織后,qRT-PCR檢測(cè)組織中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表達(dá)水平;westernblot檢測(cè)肝臟組織中MAPK6蛋白表達(dá)水平。3.人正常肝細(xì)胞QSG-7701培養(yǎng)于含有10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中,缺氧/復(fù)氧組先后給予缺氧和復(fù)氧處理。4.細(xì)胞處理完成后,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表達(dá)水平;westernblot檢測(cè)肝細(xì)胞中MAPK6蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.與假手術(shù)組大鼠相比,肝臟I/R損傷模型大鼠AST和ALT的血清水平顯著升高;而丙泊酚干預(yù)組模型大鼠血清中AST和ALT的水平顯著低于肝臟I/R損傷模型大鼠。2.肝臟I/R可顯著抑制大鼠肝組織中miR-133a-5p表達(dá),而丙泊酚預(yù)處理可顯著上調(diào)其表達(dá);MAPK6在I/R損傷的肝臟組織中表達(dá)顯著升高,而丙泊酚預(yù)處理顯著抑制MAPK6在I/R模型肝臟組織中的表達(dá);3.缺氧/復(fù)氧處理導(dǎo)致肝細(xì)胞中miR-133a-5p表達(dá)顯著降低,但MAPK6的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。與缺氧/復(fù)氧處理組相比,缺氧/復(fù)氧和丙泊酚預(yù)處理顯著上調(diào)miR-133a-5p表達(dá)并抑制MAPK6的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論:1.丙泊酚預(yù)處理可顯著降低肝臟I/R模型大鼠AST和ALT的血清水平,進(jìn)而保護(hù)肝臟I/R損傷。2.肝臟I/R模型大鼠肝臟組織中miR-133a-5p表達(dá)降低而MAPK6表達(dá)顯著升高;丙泊酚預(yù)處理上調(diào)了模型大鼠肝臟組織中miR-133a-5p表達(dá)同時(shí)下調(diào)了MAPK6表達(dá)。3.建立正常肝細(xì)胞QSG-7701病理模型,缺氧/復(fù)氧處理引起細(xì)胞中miR-133a-5p表達(dá)降低而MAPK6表達(dá)升高;丙泊酚預(yù)處理細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了缺氧/復(fù)氧對(duì)肝細(xì)胞的作用,同時(shí)伴隨著miR-133a-5p表達(dá)升高,MAPK6表達(dá)降低。第二部分:丙泊酚在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用及其調(diào)控miR-133a-5p/MAPK6表達(dá)的機(jī)制研究目的:細(xì)胞水平探討丙泊酚對(duì)肝臟I/R損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法:1.生物信息學(xué)軟件分析miR-133a-5p與MAPK的序列關(guān)系;取MAPK63’UTR部分構(gòu)建熒光載體,轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因法鑒定miR-133a-5p與MAPK的調(diào)控關(guān)系。2.分別構(gòu)建miR-133a-5p過(guò)表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞,real-timePCR和westernblot檢測(cè)細(xì)胞中MAPK6的表達(dá)。3.建立肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,并轉(zhuǎn)染miR-133a-5p過(guò)表達(dá)載體,qRT-PCR和westernblot檢測(cè)MAPK6的表達(dá)。4.建立肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,在缺氧/復(fù)氧處理前進(jìn)行丙泊酚預(yù)處理,同時(shí)構(gòu)建miR-133a-5p抑制表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,qRT-PCR和westernblot檢測(cè)MAPK6的表達(dá)。5.建立肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,在缺氧/復(fù)氧處理前利用丙泊酚處理,同時(shí)構(gòu)建MAPK過(guò)表達(dá)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果:1.MiR-133a-5p負(fù)調(diào)控MAPK6的表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-133a-5p顯著下調(diào)MAPK6的mRNA和蛋白水平的表達(dá),干擾miR-133a-5p顯著上調(diào)MAPK6的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。2.肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧處理顯著上調(diào)MAPK6的表達(dá),而過(guò)表達(dá)miR-133a-5p顯著逆轉(zhuǎn)了該結(jié)果。3.丙泊酚預(yù)處理顯著抑制了缺氧/復(fù)氧引起的肝細(xì)胞中MAPK6表達(dá)的上調(diào),而干擾miR-133a-5p消除了丙泊酚對(duì)MAPK6表達(dá)的影響;4.缺氧/復(fù)氧顯著增加了肝細(xì)胞的凋亡,丙泊酚預(yù)處理抑制了缺氧/復(fù)氧誘發(fā)的肝細(xì)胞凋亡,而過(guò)表達(dá)MAPK6消除了丙泊酚對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)論:丙泊酚預(yù)處理通過(guò)上調(diào)miR-133a-5p抑制MAPK6表達(dá)進(jìn)而抑制了缺氧/復(fù)氧誘發(fā)的肝細(xì)胞凋亡。第三部分:抑制miR-133a-5p對(duì)丙泊酚緩解大鼠肝臟I/R損傷影響的觀察目的:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證丙泊酚在肝臟I/R損傷中的保護(hù)作用機(jī)制。方法:1.實(shí)驗(yàn)分組為肝臟I/R組(HI/R)、肝臟I/R+丙泊酚組(HI/R+propofol)、肝臟I/R+丙泊酚+NC組(HI/R+propofol+NC)、肝臟I/R+丙泊酚+miR-133a-5pinhibitor組,全自動(dòng)生化分析儀直接檢測(cè)不同處理組大鼠AST和ALT的血清水平;2.取上述實(shí)驗(yàn)中所有大鼠的肝臟組織,qRT-PCR和westernblot檢測(cè)肝臟組織中MAPK6mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.肝臟I/R大鼠血清中ALT和AST的水平顯著上調(diào),丙泊酚預(yù)處理下調(diào)了ALT和AST水平,而miR-133a-5pinhibitor取消了丙泊酚對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用。2.大鼠肝臟缺血再灌組大鼠MAPK6的表達(dá)水平顯著上調(diào),丙泊酚預(yù)處理下調(diào)了MAPK6的表達(dá)水平,而miR-133a-5pinhibitor取消了丙泊酚對(duì)損傷肝組織中MAPK6表達(dá)的影響。結(jié)論:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙泊酚通過(guò)miR-133a-5p調(diào)節(jié)