2022年動物源細菌耐藥性監(jiān)測采樣和檢測技術(shù)要點

動物源細菌耐藥性監(jiān)測采樣和檢測技術(shù)要點

一'采樣安排

（一）采樣地點

各相關(guān)省級獸醫(yī)行政治理部門應(yīng)在各自轄區(qū)范圍內(nèi)選定符

合數(shù)量要求的定點養(yǎng)殖場并報農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局備案，且須保證采樣

的穩(wěn)定性和連續(xù)性。

各監(jiān)測任務(wù)承當單位按照（監(jiān)測方案）以及采樣地省級獸醫(yī)

行政治理部門提供的定點養(yǎng)殖場進行采樣和別離細菌；負責對該

省設(shè)立的全國定點監(jiān)測場長期跟蹤監(jiān)測大腸桿菌和腸球菌耐藥

性變化趨勢，每年采樣2次，分上半年和下半年進行。

（二）采樣類型

采集泄殖腔或盲腸拭子作大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌和彎

曲桿菌別離；采集新奇牛奶作金黃色葡萄球菌別離，依據(jù)養(yǎng)殖場

規(guī)模，每個場采樣50-100份。

（三）監(jiān)測的細菌種類

包含大腸桿菌、腸球菌（分為屎腸球菌和糞腸球菌）、沙門

氏菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌（分為空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎

曲桿菌）等。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可依據(jù)各地別離情況進行

監(jiān)測。

二、獸藥使用調(diào)查

各監(jiān)測任務(wù)承當單位要認真做好飼料和飼料藥物添加劑來

源與種類調(diào)查、采樣前動物使用抗菌藥物情況調(diào)查（預(yù)防用藥和

醫(yī)治用藥）和采集樣品的統(tǒng)計，據(jù)實填寫采樣記錄表。

三、細菌別離與鑒定

采納選擇性培養(yǎng)基，定向做大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌、

金黃色葡萄球菌和彎曲桿菌別離，用生化試驗、PCR技術(shù)或血清

學(xué)方法對別離物進行鑒定。本年度別離監(jiān)測的細菌種類與數(shù)量要

求見（監(jiān)測方案）。別離到的菌株在-20七以下加甘油愛護劑冷凍

保存或用其它適宜方法自行保存，沙門氏菌和彎曲桿菌送中國獸

醫(yī)藥品監(jiān)察所進行血清型鑒定后保存。

四、藥物敏感性測定

采納經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所質(zhì)量認定的藥敏試驗板進行藥

物敏感性檢測。目前，已實施質(zhì)量認定的藥敏板生產(chǎn)企業(yè)有：金

章科技開展和上海星百生物技術(shù)。

檢測用質(zhì)控菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所統(tǒng)一供給。

五、結(jié)果報送

由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所將本年度總結(jié)任務(wù)分配到各監(jiān)測任

務(wù)承當單位。各單位需在11月25日之前完成，并將電子版總結(jié)

報送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所匯總，在12

月31日前報送農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局。

采樣記錄表

采樣地：養(yǎng)殖場：

采樣時間：姓名、電話：

樣品來源

□豬日齡□消化道□呼吸道□泌尿生殖道

□雞日齡—□肝膽□腦□淋巴結(jié)

□牛日齡—□關(guān)節(jié)□奶樣□皮膚

其他日齡□糞便其他

采樣動物健康狀況養(yǎng)殖量

口健康口發(fā)病及病癥：__________________________________________

采樣養(yǎng)殖場使用抗菌藥情況

飼料來源、添加抗菌藥種類醫(yī)治用抗菌藥種類與使用方法

生產(chǎn)廠名稱藥物名稱

飼料添加的藥物名稱使用方法

劑量劑量單個動物劑量

使用時間飲水添加劑量

飼料添加劑量

用藥天數(shù)

樣品別離菌株

□大腸桿菌菌株編號：

□金黃色葡萄球菌注：菌株編號按照“菌種、來源-采樣地、采樣年月-菌株編號”

的格式進行。如EB-L0701-0001,其中：E（大腸桿菌）B（牛）

□腸球菌L（魯）07（年）01（月）-0001（菌株編號）。

□沙門氏菌菌種簡寫建議為：E（大腸桿菌）、S（沙門氏菌）、SA（金黃色

葡萄球菌）、ECi（腸球菌）、CJ（空腸彎曲桿菌）、CC（結(jié)腸彎

□空腸彎曲桿菌曲桿菌）

其他__________________動物簡寫建議為：B（牛）、P（豬）、C（雞）

注：a為喂奶豬或保溫雞，b為保育豬或生長雞，c為育成豬或雞，d為種母豬或產(chǎn)蛋雞。

動物源細菌別離和鑒定方法

一、動物源大腸桿菌的別離與鑒定

1范圍

本方法規(guī)定了用于動物源大腸桿菌別離與鑒定的方法。

本方法適用于各種動物中大腸桿菌的別離與鑒定。

2設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。

2.1冰箱：2-4。（2和-201。

2.2恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃O

2.3電子天平：感量0.1g。

2.4顯微鏡：10X-100Xo

2.5生物安全柜。

2.6生化鑒定卡或商品化試紙條。

2.7采樣管或商品化采樣棉拭子。

2.8微量加樣器：1uL~1000uLo

2.9吸頭（與微量加樣器匹配）。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1運送培養(yǎng)基。

3.2麥康凱瓊脂。

3.3大腸桿菌陽性血清。

4大腸桿菌別離與鑒定程序

大腸桿菌別離與鑒定程序見圖1。

圖1:大腸桿菌別離與鑒定程序

5.操作步驟

5.1采樣

選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，滅菌棉拭子采集動物肛門或泄殖腔樣品，置入運送培

養(yǎng)基中，保存時間不超過48小時。

5.2大腸桿菌的別離

拭子接種于麥康凱瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)18-24h；

挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，麥康凱瓊脂純化一代，

純化后可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板純化，36±1（培養(yǎng)16-18h,待進一步細菌鑒

定。

5.3大腸桿菌的鑒定

對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒

定。

必要時，采納大腸桿菌標準血清進行血清型鑒定。

二、動物源沙門氏菌的別離與鑒定

1范圍

本方法規(guī)定了用于動物源沙門氏菌別離與鑒定的方法。

本方法適用于各種動物中沙門氏菌的別離與鑒定。

2設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。

2.1冰箱：2。04（和-2CTC。

2.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃和42℃±1℃。

2.3電子天平：感量0.1g。

2.4顯微鏡：10X?100X。

2.5生物安全柜。

2.6恒溫水浴鍋：37℃~100℃o

2.7PCR儀。

2.8電泳儀。

2.9電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（或紫外透射儀）。

2.10冷凍離心機。

2.11采樣管或商品化采樣拭子。

2.12小型離心管。

2.13微量加樣器：luL?IOOONL。

2.14吸頭（與微量加樣器匹配）。

2.15漩渦儀。

2.16微波爐。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1標準菌株：沙門氏菌CVCC541

3.2DNAMaker

3.3TaqDNA聚合酶

3.4dNTP

3.5瓊脂糖

3.65XTBE緩沖液

三羥甲基氨基甲烷(Tris)54.0g

硼酸27.5g

0.5MEDTA(pH8.0)20mL

加純潔水至1000mL

3.750XTAEbuffer

三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g

NA2EDTA.2H2037.2g

醋酸57.1ml

加純潔水至1000mL

3.8invA基因引物

上游為5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'

下游為5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'

3.9運送培養(yǎng)基。

3.11沙門氏菌顯色瓊脂。

3.12沙門氏菌陽性血清。

3.13亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)o

3.14四硫磺酸鹽增菌液(TTB)o

3.15核酸染料。

3.16氯化鈉。

4沙門氏菌別離與鑒定程序

沙門氏菌別離與鑒定程序見圖2。

圖2沙門氏菌的別離和鑒定程序

5.操作步驟

5.1采樣

選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，用滅菌棉拭子采集動物腸道或泄殖腔（肛門）樣品，

置入運送培養(yǎng)基中，保存時間不超過48小時。

5.2沙門氏菌的別離

將拭子置于SC增菌液，36±1℃培養(yǎng)18-24h或TTB增菌液，42±1℃培養(yǎng)

22-24ho

將菌液混勻，接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，36±1七培養(yǎng)22-2411。

挑取沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上紫色可疑菌落，接種營養(yǎng)瓊脂平板，36±19培養(yǎng)

16-24h,待進一步細菌鑒定。

5.3沙門氏菌的鑒定

生化鑒定

對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒

定，或者通過的方法進行分子生物學(xué)（PCR）鑒定。

必要時，用沙門氏菌標準血清進行血清型鑒定。

PCR法鑒定

.1PCR模板的制備

用接種環(huán)從營養(yǎng)瓊脂上挑選16-24h的純培養(yǎng)物，置于0.5mL滅菌生理鹽水

中，12022r/min離心2min,棄上清。再加0.5mL滅菌水，懸浮并渦旋混勻，100℃

沸水中煮沸l(wèi)Omin后，移至冰上，冷卻后以12022r/min離心2min,取上清液為PCR

模板。

.2PCR反響體系的配制

依據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反響體系，擴增片段長度約284bp0

.3PCR反響條件

95℃預(yù)變性5min,94°C變性30s,64°C退火30s,72°C延伸30s,30個循環(huán)，

最后72°C延伸lOmin,同時設(shè)立陰性和陽性對比。

.4電泳

.4.11.2%瓊脂糖凝膠板的制備

稱取1.2g瓊脂糖,參加100mL0.5X脂E（或LXTAE）緩沖液中，參加核酸染

料，依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子，瓊脂糖溶化后混勻倒入在水平臺面上的凝膠盤

中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子，取出膠塊放入電泳槽中，加

0.5XTBE（或1XTAE）緩沖液淹沒膠面。

.4.2加樣

取IORLPCR擴增產(chǎn)物和3|iL上樣緩沖液混勻后參加加樣孔，每次電泳時，各做

一個陽性對比和陰性對比。

.4.3電泳條件

電壓110V,電泳時間30min。

.5結(jié)果判定

電泳結(jié)束后，取出膠塊置于紫外投射儀上翻開紫外燈觀察或用凝膠成像儀進

行成像分析。

如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與沙門氏菌陽性對比的條帶在一條直線

上，即條帶與加樣孔的距離相同，而陰性對比無此條帶，則該樣品別離到的菌株

可初步判定為沙門氏菌，必要時可通過測序來進一步確證。

三、動物源金黃色葡萄球菌的別離與鑒定

1范圍

本標準規(guī)定了用于耐藥性測定的動物源金黃色葡萄球菌的別離和鑒定方法。

本標準適用于牛奶、動物組織和上呼吸道中金黃色葡萄球菌的別離和鑒定。

2設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1冰箱：0。04。＜3和-20。（3。

2.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃和42℃。

2.3顯微鏡：10X-100Xo

2.4商品化或zi制采樣管。

2.5無菌離心管

2.6離心機。

2.8商品化拭條或微生物鑒定儀。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1標準菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213

3.2顯色培養(yǎng)基

3.37.5%氯化鈉肉湯10%氯化鈉胰酪陳大豆肉湯

3.4營養(yǎng)肉湯或BHI肉湯

3.5營養(yǎng)瓊脂

3.6新奇兔血漿或商品用凝固酶試驗兔血漿

3.70.3%過氧化氫液

3.80.85%無菌生理鹽水

4金黃色葡萄球菌別離和鑒定程序

金黃色葡萄球菌別離和鑒定程序見圖3。

圖3金黃色葡萄球菌別離和鑒定程序

5操作步驟

5.1采樣

牛奶樣品：到已選定的奶牛養(yǎng)殖場，現(xiàn)場采牛奶置入滅菌試管中，0-4七保存，

不超過48ho

扁桃體、發(fā)病動物組織和上呼吸道拭子：無菌操作取發(fā)病動物組織和上呼吸道拭

子，上呼吸道拭子置入滅菌試管中，0-4T保存不超過48h。

吸取1mL牛奶樣品或?qū)⑸虾粑朗米又潦⒂?0mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化

鈉胰酪膿大豆肉湯中，振蕩混勻。

5.2增菌和別離培養(yǎng)

將上述樣品勻液于36±1℃培養(yǎng)18-24ho金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉

湯中呈混濁生長。

將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到顯色培養(yǎng)基平板上，無菌操作將發(fā)病動物組織

直接劃線，36±1。（2培養(yǎng)24-48h。

挑取可疑菌落。用營養(yǎng)瓊脂純化一代，待進一步細菌鑒定。

5.3金黃色葡萄球菌的鑒定

生化鑒定將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時以內(nèi)的待鑒定細菌，首先進行觸酶試驗,

應(yīng)為陽性。

將新奇純化、經(jīng)觸酶試驗陽性待檢細菌單個菌落，懸浮于5mL滅菌生理鹽水,

按照生化鑒定試條使用說明書操作，37C培養(yǎng)18-24h后判讀結(jié)果。

血漿凝固酶試驗法挑取顯色平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI

和營養(yǎng)瓊脂平板，36±HC培養(yǎng)18-24h。將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24h以內(nèi)的待鑒定

細菌，首先進行觸酶試驗，應(yīng)為陽性。

新奇兔血漿制備：稱取檸檬酸鈉3.8g,加蒸^水100mL,溶化后過濾，裝瓶,

121℃高壓滅菌15mino取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置（或

以3000r/min離心30min）,使血液細胞下降，即可得血漿。

取新奇配置兔血漿0.5mL,放入小試管中，再參加BHI培養(yǎng)物0.2-0.3mL,

振蕩搖勻，置36±rc溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h,如呈現(xiàn)

凝固（馬上試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判

定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作

為對比。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。

四、動物源彎曲桿菌的別離與鑒定

1范圍

本標準規(guī)定了動物源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的別離鑒定方法。

本標準適用于糞便拭子和盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的別離與

鑒定。

2設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌與培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。

2.1采樣管

2.2采樣棉拭子

2.3生物安全柜

2.4恒溫培養(yǎng)箱：25℃±1℃,36℃±1℃,42℃±l℃o

2.5恒溫水浴鍋：37℃-100℃o

2.6微需氧條件：5%氧氣+10%二氧化碳+85%氮氣，或商品化微需氧包。

2.7顯微鏡：10X-100Xo

2.8微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化鑒定拭條

2.9高速冷凍離心機：N12022r/min。

2.10小型離心管：1.5mLo

2.11微量加樣器：1uL?lOOOuL。

2.12吸頭（與微量加樣器相匹配）

2.13PCR儀

2.14微波爐

2.15電泳儀

2.16電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(或紫外透射儀)

3、培養(yǎng)基和試劑

3.1質(zhì)控菌株：空腸彎曲桿菌標準菌株(ATCC33560)

3.2DNAMarker

3.3引物及擴增片段長度

引物

空腸彎曲菌：上游5'CATCTTCCCTAGTCAAGCCT3',下游5'AAGATA

TGGCACTAGCAAGAC3',擴增片段長度為773bp。

結(jié)腸彎曲桿菌：上游：AGGCAAGGGAGCCTTTAATC,下游：TATCCCTATCTA

CAAATTCGCTATCCCTATCTACAAATTCGC,擴增片段長度為364bp。

3.4運送培養(yǎng)基

3.5彎曲菌選擇性(CCD)培養(yǎng)基

3.6哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基

3.7生理鹽水

3.810XPCR緩沖溶液H

3.9氯化鎂溶液(25mM)

3.10Taq聚合酶(0.5U/uL)

3.11dNTPs(2mM)

3.12瓊脂糖

3.1350XTAE緩沖液：將242gTris堿，57.1mL冰乙酸，lOOmLO.5MEDTA

(pH8.0),加純水至1000mL。

1XTAE緩沖液：臨用時將50XTAE緩沖液1份加蒸儲水49份，混勻即可。

3.14上樣緩沖液

3.15澳化乙錠溶液(10mg/mL)：稱取1g澳化乙錠溶于100mL水中，用磁力

攪拌器攪拌數(shù)小時直至完全溶化，避光冷藏(4T)保存。

3.16礦物油

4空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的別離與鑒定程序

空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的別離與鑒定程序見圖4。

圖4彎曲桿菌的別離和鑒定程序

5操作步驟

5.1別離與純化

別離

將新奇或者運送培養(yǎng)基中的糞便拭子或盲腸內(nèi)容物在CCD培養(yǎng)基上涂抹，用

經(jīng)火焰滅菌并冷卻的接種環(huán)與涂抹處垂直劃線。

培養(yǎng)

將上述接種后的平板置于42^±1￡恒溫培養(yǎng)箱中，在微需氧條件下培養(yǎng)

24h-48ho

純化

觀察24h培養(yǎng)與48h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)。挑取灰色、濕潤、凸起、

光滑圓潤、邊緣齊整的可疑單菌落，按3.2的培養(yǎng)條件培養(yǎng)純化。

5.2鑒定

生化鑒定

對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒

定，并進行結(jié)果判定?；蛘咄ㄟ^5.1-5.4的試驗進行分子生物學(xué)（PCR）鑒定。

分子生物學(xué)（PCR）鑒定

用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上挑取適量的純培養(yǎng)物置于盛有0.5mL生

理鹽水的小型離心管中,12022r/min離心2min,棄上清。再加0.5mL滅菌水,懸

浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸l(wèi)Omin后，取出置于冰浴中冷卻5min后，

12022r/min（4℃）離心2min,取上清作為PCR模板。

.1PCR反響體系

依據(jù)不同廠家PCR試劑用量，配制PCR反響體系。同時設(shè)立陰性和陽性對比。

.2PCR反響條件

采納的PCR反響條件見下表。

PCR反響程序表

5min,94℃

Imin,94℃,Imin,64℃,lmin,72℃,2x

Imin,94℃,Imin,62℃,lmin,72℃,2x

lmin,94℃,lmin,60℃,lmin,72℃,2x

lmin,94℃,lmin,58℃,lmin,72℃,2x

Imin,94℃,Imin,56℃,lmin,72℃,2x

Imin,94℃,Imin,54℃,lmin,72℃,30x

10min,72℃

.3電泳

.3.11.0%瓊脂糖凝膠板的制備

稱取1.0g瓊脂糖，參加lOOmLO.5XTBE緩沖液（或1XTAE緩沖液）中。加熱

融化后加5uL（10mg/mL）澳化乙錠，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，

膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠

中形成加樣孔），放入電泳槽中，加0.5XTBE緩沖液（或1XTAE緩沖液）淹沒膠

面。

.3.2加樣

取IORLPCR擴增產(chǎn)物和3|JL上樣緩沖液混勻后參加一個加樣孔。每次電泳加

陽性對比和陰性對比的擴增產(chǎn)物各1孔作為對比。

.3.3電泳條件

電壓110V,電泳時間40min。

.4結(jié)果判定

電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上翻開紫外燈觀察或用凝膠成像儀

進行成像分析。

如果某一待檢樣品擴增產(chǎn)物的條帶與空腸彎曲菌陽性對比的條帶在一條直

線上，即它們與加樣孔的距離相同，則該樣品別離到的菌株可判定為空腸彎曲桿

菌；如果與結(jié)腸彎曲菌陽性對比的條帶在一條直線上，即它們與加樣孔的距離相

同，則該樣品別離到的菌株可判定為結(jié)腸彎曲桿菌；

必要時，可以通過測序來進一步確證。

五、動物源屎腸球菌和糞腸球菌的別離與鑒定

1范圍

本方法規(guī)定了用于屎腸球菌和糞腸球菌別離與鑒定的方法。

本方法適用于各種動物中屎腸球菌和糞腸球菌的別離與鑒定。

2設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下。

2.1冰箱：2-4C和-2(TC。

2.2恒溫培養(yǎng)箱：36±l℃o

2.3電子天平：感量0.1g。

2.4顯微鏡：10X~100Xo

2.5生物安全柜。

2.6生化鑒定卡或商品化試條。

2.7采樣管或商品化采樣棉拭子。

2.8微量加樣器：luLTOOOuL。

2.9吸頭l與微量加樣器匹配）。

3培養(yǎng)基和試劑

3.1運送培養(yǎng)基。

3.2腸球菌顯色培養(yǎng)基。

4屎腸球菌和糞腸球菌別離與鑒定程序

屎腸球菌和糞腸球菌別離與鑒定程序見圖5。

圖5：屎腸球菌和糞腸球菌別離與鑒定程序

5.操作步驟

5.1采樣

選擇養(yǎng)殖場或屠宰場，滅菌棉拭子采集動物肛門或泄殖腔樣品，置入運送培

養(yǎng)基中，保存時間不超過48小時。

5.2屎腸球菌和糞腸球菌的別離

拭子接種于腸球菌顯色瓊脂平板，36±1。（2培養(yǎng)18-24h；

挑取紅色至紫紅色的可疑菌落，顯色瓊脂上純化一代，

純化后可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板純化，36±1C培養(yǎng)16T8h,待進一步細菌鑒

定。

5.3屎腸球菌和糞腸球菌的鑒定

對于已純化的菌落，可使用微生物生化鑒定系統(tǒng)或者生化拭條進行生化鑒

定、判定結(jié)果。

必要時，采納腸球菌標準血清進行血清型鑒定。

藥敏試驗檢測試劑盒［MIC測定〕使用方法

1.范圍

本方法規(guī)定了動物源細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌）

藥敏檢測試劑盒的使用方法。

2.材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1恒溫培養(yǎng)箱35±2℃

2.2生物安全柜

2.3濁度計或者標準比濁管

2.3微量加樣器luL-1000uL

2.4吸頭（與微量加樣器匹配）

3.操作步驟

3.1取出試劑盒，翻開包裝待用。

3.2菌液制備

將無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個新奇菌落，與適量

無菌生理鹽水混勻。然后，用標準比濁管或者濁度計校正菌液濃度至0.5麥氏單

8

位（l-2X10CFU/mL）o最后，用試劑盒中的肉湯100倍稀釋，混勻備用。

3.3菌液接種

除空白對比外，其余的95孔參加制備好（用前要混勻）的菌液100叱

空白對比孔中參加100叱無菌肉湯。蓋好板蓋并記錄菌號。

3.4孵育

將檢測板置于35℃±2。（3很穩(wěn)培養(yǎng)箱中孵育16-18小時。

3.5觀察結(jié)果

在襯有黑底板的光線下，用肉眼觀察。

先觀察陰性對比孔和陽性對比孔：陰性對比孔應(yīng)無細菌生長，孔內(nèi)液體未見

渾濁；陽性對比孔內(nèi)應(yīng)有細菌生長所形成的圓形或者網(wǎng)狀沉淀。

如果陰性和陽性對比結(jié)果正常，繼續(xù)觀察其余孔內(nèi)細菌生長情況，在無細菌

生長的孔內(nèi)所含最di抗菌藥物濃度即為最di抑菌濃度（MIC）。

4.結(jié)果記錄

將MIC結(jié)果記錄在耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計表。中。

耐藥性檢測結(jié)果統(tǒng)計表

1.大腸桿菌和沙門氏菌

養(yǎng)殖場：檢測員：年月日

菌氨阿莫頭頭慶大四多氟磺復(fù)恩氧美乙黏

株革西林抱抱大觀環(huán)西苯胺方諾氟羅酰菌

編西/克噬他霉霉素環(huán)尼異新沙沙培甲素

號林拉維吠咤素素素考噂諾星星南喳

酸嗤明

AA/EFCAGSPTDFFSSXENOFIPMQPM

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