木質(zhì)纖維素高效降解的動物源機制

木質(zhì)纖維素高效降解的動物源機制葉美瀛;陳雪;劉研萍【摘要】生物質(zhì)資源在解決能源短缺和環(huán)境污染方面有著巨大的潛力,但生物質(zhì)的低成本高效轉化利用機制仍需進行深入研究.在動物源木質(zhì)纖維素降解體系中,選取低等白蟻進行了系統(tǒng)分析,由于其體內(nèi)具有高效轉化木質(zhì)纖維素系統(tǒng),其腸道消化體系是一個非常高效的“生物反應器”.白蟻體內(nèi)含豐富的木質(zhì)纖維素降解酶系和高效微生物資源,在白蟻-共生微生物雙重作用下,纖維素和半纖維素能夠被高效降解.通過分子生物技術,可對纖維素酶和半纖維素酶進行異源表達,表達產(chǎn)物活性高.文章闡述了低等白蟻的木質(zhì)纖維素降解酶系統(tǒng),共生微生物的多樣性及功能和高效降解木質(zhì)纖維素機制,以及木質(zhì)纖維素酶異源表達情況,為生物質(zhì)低成本、系統(tǒng)的高效轉化利用提供新的方向和思路.期刊名稱】《中國沼氣》年(卷),期】2016(034)002【總頁數(shù)】6頁(P18-23)【關鍵詞】低等白蟻;木質(zhì)纖維素降解酶;共生微生物;異源表達【作者】葉美瀛;陳雪;劉研萍【作者單位】北京化工大學環(huán)境科學與工程系,北京100029;北京國能中電節(jié)能環(huán)保技術有限責任公司,北京100020;北京化工大學環(huán)境科學與工程系,北京100029【正文語種】中文中圖分類】S216.4;TQ35木質(zhì)纖維素主要是由纖維素，半纖維素和木質(zhì)素組成，是地球上最豐富的可再生資源，具有生物燃料和生物材料生產(chǎn)的潛力［1］。木質(zhì)纖維素由于結構復雜，纖維素晶體高度有序，與半纖維素交雜在一起，被性質(zhì)穩(wěn)定的木質(zhì)素包裹起來，而難以被酶和微生物降解，導致其降解率一直不高。在自然界中，存在許多生物能夠以木質(zhì)纖維素為食來獲取營養(yǎng)物質(zhì)和能量，白蟻就是一類最具代表性的動物，大約2600種白蟻廣泛分布在世界范圍［2］。據(jù)估計，白蟻每年大約可消耗3~7億噸的木質(zhì)纖維素，能高效消化79%~99%的纖維素，對熱帶和亞熱帶地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)起著非常重要作用［3］。低等白蟻占總白蟻種類的25%，共有6個科，分別為草白蟻科、原白蟻科、澳白蟻科、木白蟻科、齒白蟻科和鼻白蟻科［4］，在我國長江以南城市廣泛分布存在，典型的有家白蟻、散白蟻、木白蟻和原白蟻等［5］。與高等白蟻相比，低等白蟻進化不完全，取食范圍略窄，它們喜歡取食富含木質(zhì)纖維素的食物，包括一些草本植物和樹木等活植物及干枯植物。白蟻能高效降解木質(zhì)纖維素主要原因是其腸道消化系統(tǒng)是一個高效的“生物反應器”，其體內(nèi)含有大量能表達木質(zhì)纖維素酶的基因，以及大量微生物在后腸共生存在，在白蟻自身及共生體的雙重作用，木質(zhì)纖維素被充分分解利用［6］。低等白蟻既是害蟲，也是資源型昆蟲，其體內(nèi)相關木質(zhì)纖維素降解酶及微生物具有重大的研究價值，對木質(zhì)纖維素降解工藝的設計具有啟發(fā)意義。文章系統(tǒng)的分析了低等白蟻的木質(zhì)纖維素降解酶體系、木質(zhì)纖維素酶的異源表達、腸道微生物的多樣性以及木質(zhì)纖維素的體內(nèi)轉化過程。低等白蟻能高效降解木質(zhì)纖維素，主要原因是其體內(nèi)具有豐富的降解木質(zhì)纖維素相關酶種類，包括內(nèi)切葡聚糖酶（EC321.4，簡稱EG酶）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.91,也稱CBH酶）和葡聚糖苷酶（EC3.2.1.21,簡稱BG酶）3種纖維素酶，以及木聚糖酶、甘露聚糖酶等半纖維素酶［7］。酶系來源包括白蟻自身產(chǎn)生的內(nèi)源性纖維素酶和共生微生物產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素降解酶。白蟻自身產(chǎn)生的內(nèi)源性纖維素酶低等白蟻自身能產(chǎn)生的內(nèi)源性纖維素酶一EG酶和BG酶，主要是在唾液腺表達分布。Inoue［8］等人研究北美散白蟻體內(nèi)纖維素酶時發(fā)現(xiàn)77.8%的EG酶和23.9%的BG酶分布在唾液腺中。80%的EG酶活性分布在臺灣乳白蟻的唾液腺中，而在中腸也分布相對較少的EG酶活性［9］［10］。關于BG酶，Zhang［11］等人用基因轉錄檢測證實了唾液腺是BG酶主要表達場所。在恒春新白蟻的唾液腺中檢測到75%BG酶活性分布，15%BG酶活分布在共生著大量鞭毛蟲的后腸部位［12］。在低等白蟻前腸及中腸都能檢測到少量的纖維素酶，一種可能原因是部分由唾液腺產(chǎn)生的纖維素酶隨木質(zhì)纖維素轉移到前腸和中腸部位。在GenBank收錄的纖維素酶基因中，根據(jù)肽序列相似性對白蟻內(nèi)源性纖維素酶進行分類，所有的EG酶屬于GHF9，而內(nèi)源性BG酶屬于GHF1［13］。共生微生物產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素降解酶纖維素酶與內(nèi)源性纖維素酶相比，低等白蟻后腸的共生原生動物能產(chǎn)生更復雜的纖維素酶。EG梅，BG梅和CBH梅3種纖維素酶均能在白蟻后腸檢測到。眾多學者利用生物學技術，在原生動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的纖維素酶的基因，不同白蟻后腸的原生動物能夠克隆出的纖維素酶基因種類具有差異。臺灣乳白蟻后腸存在3種鞭毛蟲S.leidyi，H.mirabile和P.grassii，能夠從中克隆到不同的纖維素酶基因，分別有GHF5EG［13］，GHF7EG［14］和GHF7CBH［15］。杜蕾蕾［16］通過RT-PCR和RACE技術克隆了黑胸散白蟻后腸鞭毛蟲的纖維素酶基因，經(jīng)分析該基因?qū)儆谔腔饷讣易?(GHF7)。近年來宏轉錄組學技術廣泛運用生物學研究，從低等白蟻后腸微生物獲得了眾多纖維素酶基因序列信息。Todaka［17］等人對臺灣乳白蟻、達爾文澳白蟻、恒春新白蟻和H.sjostedti原白蟻四種低等白蟻后腸共生原生動物建立了cDNA文庫并進行EST分析，可以得知GHF5EGs,GHF7EGs,GHF7CBHs和GHF45EGS是共生體纖維素酶系統(tǒng)的主要作用酶；其中GHF45EGS是達爾文澳白蟻共生原生動物的核心纖維素酶，而在恒春新白蟻后腸未檢測到其序列（見表1）。半纖維素酶白蟻能高效消化半纖維素，主要是由其后腸共生微生物產(chǎn)生的木聚糖酶等半纖維素酶在起作用。Azuma［18］等人喂食黃胸散白蟻工蟻，在喂食木聚糖21天后，顯示白蟻后腸的一些原生動物仍能存活并保持著木聚糖酶活性，表明了木聚糖酶活性與后腸原生動物息息相關。Smith和Koehler［19］研究木聚糖含量不同的食物對白蟻體內(nèi)木聚糖酶的影響，發(fā)現(xiàn)食物的木聚糖含量越高，測得的木聚糖酶越高，其中超過92%的木聚糖酶活性位于后腸，證明了木聚糖的消化主要由后腸共生微生物在起作用。Arakawa［20］等人第一次從臺灣乳白蟻提純到三種具有相同功能的木聚糖酶，克隆相應的cDNAs顯示這些木聚糖酶隸屬于GHF11,運用反轉錄-PCR技術證實相應的表達基因源自后腸全鞭毛蟲。由于木聚糖體外提純困難，提供信息不足，無法全面了解白蟻體內(nèi)半纖維酶基因。近年來廣泛運用宏轉錄組學技術來發(fā)現(xiàn)并分析白蟻體內(nèi)半纖維素酶基因，對常見的低等白蟻進行檢測，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶基因主要是由白蟻后腸細菌及原生動物產(chǎn)生的，而白蟻能否自身分泌尚未得知（見表2），檢測到的半纖維素酶主要屬于GHF10和GHF11。在鼻白蟻科中，GHF10木聚糖酶相對含量較少，起主要作用的是GHF11木聚糖酶［21］。1.3低等白蟻木質(zhì)纖維素酶的異源表達白蟻體內(nèi)的木質(zhì)纖維素酶要實現(xiàn)工業(yè)應用，進行異源表達大量生產(chǎn)重組酶是非常有必要的。在國外，有關白蟻自身及其體內(nèi)共生體的木質(zhì)纖維素酶基因體外表達的研究報道很多，EGs，BGs和木聚糖酶異源高效表達，而國內(nèi)鮮有報道。白蟻自身及其體內(nèi)共生原生動物存在大量的纖維素酶基因，異源表達獲得的重組纖維素酶活性高。Zhang［28］等人從臺灣乳白蟻自身腸道克隆到cfEG5（GHF9）并在大腸桿菌表達，結果顯示重組EG酶的比活力達到325U?mg-1。從棲北散白蟻R.speratus后腸共生原生動物克隆到一個GHF7EG基因并在米曲霉表達，重組EG酶具有高比活力(603U?mg-1)，在pH值6.5和溫度45°C條件下，酶活性最高；以CMC底物重組EG酶的米氏常數(shù)Km和Vmax分別為1.97mg?mL-1和769.6U?mg-1［29］。Ni［30］等人將從恒春新白蟻的唾液腺中獲得的NkBG基因第一次在大腸桿菌異源表達，其重組BG酶的性質(zhì)基本與白蟻體內(nèi)BG酶一致，作用于纖維二糖的Km和Vmax分別為3.8mM和220U?mg-1,最適pH值和溫度分別為5.0和45C,比活力達到156.7U?mg-1。對于重組木聚糖酶，Matteotti［31］等人根據(jù)功能活性篩選從散白蟻R.santonensis的革蘭氏陽性細菌克隆了一個木聚糖酶基因(XylB8),XylB8(GHF11)在大腸桿菌異源表達，獲得的重組木聚糖酶作用于山毛櫸材木聚糖，在pH值5.0和55C下有最大酶活性，Km和Vmax分別為9mg?mL和3333U?mg-1。Tsukagoshi［32］等人第一次從棲北散白蟻R.speratus的共生原生動物克隆到GHF26甘露聚糖酶RsMan26H并在酵母菌表達，經(jīng)過184h培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)濃度最終達到0.67g?L-1,對于底物可溶豆膠半乳甘露聚糖，最適pH值和溫度分別為5.0和40C，該酶能夠作用于低聚糖或多糖產(chǎn)生甘露二糖。低等白蟻體內(nèi)共生著大量的原生動物和古細菌、螺旋體等原核生物，對白蟻代謝活動和物質(zhì)循環(huán)起著重要的作用。在以下對低等白蟻腸道內(nèi)的原生動物和原核生物的多樣性及功能進行分析。白蟻后腸原生動物的多樣性及功能低等白蟻后腸定居著大量的共生鞭毛蟲，在木質(zhì)纖維素消化降解過程起著重要的作用。白蟻共生的鞭毛蟲均屬于超鞭毛蟲目、毛滴蟲目和銳滴蟲目［33］。鞭毛蟲可達到白蟻總體重的1/7至1/3，在后腸腸液占有相對較大的體積空間，低等白蟻種類不同，其腸道內(nèi)的鞭毛蟲種類具有差異，臺灣乳白蟻腸道內(nèi)共生著3種鞭毛蟲，而棲北散白蟻至少存在11種［34］。鞭毛蟲是低等白蟻不可或缺的存在，一方面鞭毛蟲與白蟻存在共生關系；另一方面，鞭毛蟲與細菌或古生菌存在內(nèi)(外)共生關系。低等白蟻一旦缺失鞭毛蟲就無法存活，鞭毛蟲群落的改變會影響白蟻體內(nèi)木質(zhì)纖維素酶的活性，引起共生原核生物群落發(fā)生變化［35］。毛滴蟲目和超鞭蟲目的鞭毛蟲含有氫化酶體(Hydrogenosomes)，以底物水平磷酸化的形式產(chǎn)生ATP并釋放乙酸，供白蟻代謝需要的能量。同種白蟻腸道的3種鞭毛蟲在消化木質(zhì)纖維素過程起不同的作用，最大的鞭毛蟲(P.grassii)主要消化高度聚合的纖維素，而較小的鞭毛蟲Holomastigotoideshartmanni和Spirotrichonymphaleidyi則降解低分子量的纖維素［36］。在近年來，廣泛運用宏轉錄組學技術研究低等白蟻共生微生物，其中，鞭毛蟲來源的SSUrRNA占了77.9%，從鞭毛蟲克隆出了許多纖維素酶基因，如GHF5EGS，GHF7CBHS和GHF45EG等，證實了鞭毛蟲能夠降解木質(zhì)纖維素［23］。白蟻體內(nèi)共生原核生物的多樣性及功能低等白蟻后腸腸液及鞭毛蟲細胞液存在著大量的細菌和古生菌等原核生物。從低等白蟻腸道已分離到多種好氧菌及兼性厭氧菌，但細菌菌落的難培養(yǎng)性，只有少部分原核生物被認知?，F(xiàn)在主要是依靠非培養(yǎng)式分子技術如對16SrRNA基因測序來研究原核生物的多樣性，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)低等白蟻共生細菌的主要類群有螺旋體、變形菌、厚壁菌、擬桿菌、放線菌和白蟻菌群1［37］。優(yōu)勢菌群因白蟻種類而有所差異，散白蟻屬最占優(yōu)勢的是螺旋體，而在乳白蟻的最優(yōu)勢菌是擬桿菌［38］。原核生物在低等白蟻腸道中的分布是不均勻的，有的與鞭毛蟲共生，有的游離生活于腸腔，還有的密布于后腸腸壁。螺旋體在白蟻后腸腸道游離或粘附在鞭毛蟲表面，分離純化得到的螺旋體具有還原產(chǎn)乙酸作用，能夠消耗H2/CO2還原合成乙酸［39］。產(chǎn)甲烷古菌在低等白蟻后腸腸道含量相對較少，與螺旋體競爭利用二氧化碳和氫氣，還原反應生成甲烷［40］。同時，低等白蟻后腸還存在著固氮菌、硫酸鹽還原細菌、尿酸分解菌等，參與白蟻代謝活動和物質(zhì)循環(huán)［41］。在國內(nèi)外，盡管分離純化得到了許多能降解木質(zhì)纖維素的原核生物，或通過宏轉錄組學和PCR-DGGE等技術了解了其多樣性，但它們在白蟻體內(nèi)所起的具體作用仍未明確，相互作用關系有待進一步研究。低等白蟻腸道及內(nèi)環(huán)境白蟻腸道是結構化不斷變化的微環(huán)境系，生理狀態(tài)和微生物群落結構具有明顯差異，是木質(zhì)纖維素降解的主要場所。白蟻腸道通常由前腸，中腸和后腸組成（見圖1）。前腸起源于外胚層，包含一段食道，膨大的前段（“嗉囊”）和后段（“砂囊”），主要作用是機械研磨白蟻攝入的木質(zhì)碎片；中腸呈柱狀，起源于內(nèi)胚層，是消化酶分泌和營養(yǎng)吸收的主要場所；中腸和后腸的連接處是馬氏管，具有排泄代謝廢物的功能；經(jīng)過部分消化的木質(zhì)纖維素進入到白蟻腸道最大的部分—后腸，其長度和結構復雜多變，細分可以分為P1，P2，P3,P4和P5五部分，是新陳代謝的主要場所［42］。后腸P3部分顯著膨大，生存著大量的細菌、古生菌和原生動物。膨大的腸道區(qū)域減緩了物質(zhì)在腸道的運輸，延長了消化物與腸道微生物的接觸時間，這也是白蟻能高效降解木質(zhì)纖維素的一種原因。起初白蟻的后腸被認為是一個厭氧環(huán)境，后來嚴格好氧菌及兼性厭氧菌的發(fā)現(xiàn)否定了這觀點，微電極技術的應用證實了白蟻腸道是一個漸變的系統(tǒng)，氫氧分壓在白蟻腸道空間上分布呈明顯的梯度變化，氧分壓在腸壁部位高而中心部位很低，而氫分壓而相反［38］。這樣的漸變系統(tǒng)影響微生物群落及其活性在微尺度下呈現(xiàn)多樣性的分布變化。低等白蟻腸道pH值呈弱酸性，有利酶類和微生物作用木質(zhì)纖維素。木質(zhì)纖維素在低等白蟻體內(nèi)的轉化過程低等白蟻消化降解木質(zhì)纖維素的過程可以看作機械預處理、酶水解和微生物綜合處理的過程。白蟻上顎和前胃能夠剪切或擠壓攝入的食物，降低物質(zhì)粒徑，能使木質(zhì)顆粒在前腸和后腸尾部區(qū)間達到20~100pm不等長度，是一個機械預處理的過程［10］。白蟻唾液腺能分泌內(nèi)源性纖維素酶，這些酶與木質(zhì)物質(zhì)充分混合，在轉移到前腸和中腸的過程中進行酶水解產(chǎn)生纖維素碳水化合物和一些可溶性糖類（葡萄糖和纖維二糖），部分可溶性糖類在中腸被白蟻吸收［44］。木質(zhì)纖維素主要是在白蟻后腸降解的，主要是由于白蟻后腸腸腔共生著大量的鞭毛蟲及原核生物，二者能協(xié)同作用降解轉化木質(zhì)纖維素（見圖2）。在白蟻后腸，從腸壁到后腸中心，氫分壓逐漸升高，而氧分壓恰相反，這影響了微生物群落的分布。鞭毛蟲能分泌大量的纖維素酶和半纖維酶作用于部分水解的木質(zhì)纖維素生成單糖，并被鞭毛蟲和共生原核生物利用以底物水平磷酸化形式生成乙酸、H2和。與鞭毛蟲胞內(nèi)（外）共生的產(chǎn)甲烷菌和螺旋體等細菌競爭消耗H2，產(chǎn)甲烷菌還原CO2生成甲烷（4H2+CO2-CH4+2H2O）,同型產(chǎn)乙酸菌還原CO2生成醋酸（4H2+2CO2-CH3COOH）;在有氧條件下，耐氧乳酸菌將由鞭毛蟲分解產(chǎn)生的單糖發(fā)酵為乳酸；其他類型VFAs產(chǎn)生機制未知，但離不開細菌群落的作用，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸被白蟻吸收［36，44］。另外，白蟻后腸還存在固氮菌、硫酸鹽還原細菌、尿酸分解菌等菌落，參與白蟻代謝活動和物質(zhì)循環(huán)。白蟻自身及微生物產(chǎn)生的特定木質(zhì)纖維素降解酶系在與體內(nèi)共生微生物的協(xié)同作用下，木質(zhì)纖維素被高效降解利用，但具體的降解機制仍未完全清楚，還需進一步研究。我國具有豐富的生物質(zhì)資源，但一直面臨轉化效率不高的問題。白蟻是一座值得挖掘開發(fā)的寶庫，其腸道消化系統(tǒng)是個非常高效的“生物反應器”，對木質(zhì)纖維素具有非凡轉化利用能力，遠超現(xiàn)有任何技術。白蟻的“機械預處理-復合酶水解-微生物降解”高效轉化木質(zhì)纖維素機制，對攻克生物質(zhì)利用的關鍵技術和理論方面具有極大的科學借鑒價值。白蟻體內(nèi)高效木質(zhì)纖維素降解酶系統(tǒng)資源值得挖掘及其工程化利用，對高效微生物資源進行篩選、改造與利用。白蟻獨特的高效生物質(zhì)轉化的能力及其背后的生物作用機制、理化作用原理及其物態(tài)演變的規(guī)律被揭開，人們就能夠通過現(xiàn)代生物技術與工程技術相結合，對這一機制和過程進行模擬，構建一個仿生集成系統(tǒng)，實現(xiàn)生物質(zhì)高效轉化的過程化利用?！鞠嚓P文獻】HimmelME,DingSY,JohnsonDK,etal.Biomassrecalcitrance:engineeringplantsandenzymesforbiofuelsproduction[J].science,2007,315(5813):804-807.EggletonP.Anintroductiontotermites:biology,taxonomyandfunctionalmorphology[M].Biologyoftermites:amodernsynthesis.SpringerNetherlands,2011:126.BreznakJA,BruneA.Roleofmicroorganismsinthedigestionoflignocellulosebytermites[J].Annualreviewofentomology,1994,39(1):453-487.LoN,EggletonP.Termitephylogeneticsandco-cladogenesiswithsymbionts[M].SpringerNetherlands,Biologyoftermites:amodernsynthesis,2011:27-50.⑸蔡邦華,陳寧生?中國白蟻分類和區(qū)系問題J].昆蟲學報,1964,1:25-37.NakashimaK,WatanabeH,SaitohH,etal.Dualcellulose-digestingsystemofthewood-feedingtermite,CoptotermesformosanusShiraki[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology,2002,32(7):777-784.NiJ,TokudaG.Lignocellulose-degradingenzymesfromtermitesandtheirsymbioticmicrobiota[J].Biotechnologyadvances,2013,31(6):838-850.InoueT,MurashimaK,AzumaJI,etal.CelluloseandXylanUtilisationintheLowerTermiteReticulitermessperatus[J].Journalofinsectphysiology,1997,43(3):235-242.NakashimaK,AzumaJ.Distributionandpropertiesofendo-p-1,4-glucanasefromalowertermite,Coptotermesformosanus(Shiraki)[J].Biosciencebiotechnologyandbiochemistry,2000,64(7):1500-1506.FujitaA,HojoM,AoyagiT,etal.DetailsofthedigestivesysteminthemidgutofCoptotermesformosanusShiraki[J].Journalofwoodscience,2010,56(3):222-226.ZhangD,AllenAB,LaxAR.Functionalanalysesofthedigestivep-glucosidaseofFormosansubterraneantermites(Coptotermesformosanus)[J].Journalofinsectphysiology,2012,58(1):205-210.TokudaG,SaitoH,WatanabeH.Adigestivep-glucosidasefromthesalivaryglandsofthetermite,Neotermeskoshunensis(Shiraki):distribution,characterizationandisolationofitsprecursorcDNAby5'-and3'-RACEamplificationswithdegenerateprimers[J].Insectbiochemistryandmolecularbiology,2002,32(12):1681-1689.InoueT,MoriyaS,OhkumaM,etal.Molecularcloningandcharacterizationofacellulasegenefromasymbioticprotistofthelowertermite,Coptotermesformosanus[J].Gene,2005,349:67-75.WatanabeH,NakashimaK,SaitoH,etal.Newendo-p-1,4-glucanasesfromtheparabasaliansymbionts,PseudotrichonymphagrassiiandHolomastigotoidesmirabileofCoptotermestermites[J].CellularandMolecularLifeSciencesCMLS,2002,59(11):19831992.NakashimaK,WatanabeH,AzumaJI.CellulasegenesfromtheparabasaliansymbiontPseudotrichonymphagrassiiinthehindgutofthewood-feedingtermiteCoptotermesformosanus[J].CellularandMolecularLifeSciencesCMLS,2002,59(9):15541560.杜蕾蕾.黑胸散白蟻(ReticulitermeschineseSn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