塵螨、豚草、曲霉粗提物誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥及以Syk為靶點(diǎn)化合物Vam3抗炎機(jī)制研究

塵螨、豚草、曲霉粗提物誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥及以Syk為靶點(diǎn)化合物Vam3抗炎機(jī)制研究目前全球大約有3億人患哮喘,其中多數(shù)患者通過(guò)吸入免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素)和p-腎上腺素受體激動(dòng)劑治療急性哮喘,獲得良好的效果。然而大約5%～10%的慢性哮喘患者卻對(duì)此類(lèi)治療反應(yīng)效果較差?；陬?lèi)固醇拮抗型氣道炎癥嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康,且發(fā)病機(jī)制尚未明確,因此在此類(lèi)疾病的預(yù)防、診斷、治療上還存在很大的缺口,現(xiàn)有的部分臨床治療藥物也存在長(zhǎng)期的副作用或難吸收等各種各樣的問(wèn)題,研究類(lèi)固醇拮抗型氣道炎癥機(jī)制和開(kāi)發(fā)針對(duì)此類(lèi)疾病有效的藥物成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。本研究的目的是探索慢性氣道炎癥機(jī)制,并評(píng)價(jià)以Km(米氏常數(shù))原理高通量篩選的Syk激酶特異性抑制劑Vam3的抗炎機(jī)制,以期開(kāi)發(fā)出具有治療慢性氣道炎癥的一類(lèi)新藥。大多數(shù)哮喘患者的致敏原為環(huán)境中的多種抗原,但在多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中只使用一種過(guò)敏原,不能反映患者發(fā)病機(jī)制的本質(zhì)。本研究通過(guò)采用患者常見(jiàn)的塵螨、豚草和曲霉菌屬組成的3類(lèi)過(guò)敏原復(fù)合物(DRA)免疫動(dòng)物,建立了慢性哮喘模型,并發(fā)現(xiàn)在慢性氣道炎癥中通過(guò)NF-κB影響炎癥因子IL-8表達(dá)與活性的作用機(jī)制。首先,將雌性BALB/c小鼠分為3組,模型組和藥物組中塵螨、豚草和曲霉菌屬(DRA)作為抗原,生理鹽水作為對(duì)照,重復(fù)免疫動(dòng)物10周。其次,藥物組中地塞米松作為治療藥物,對(duì)照組和模型組中生理鹽水作為安慰劑,口服灌胃兩周,每天1次。結(jié)果觀察到DRA增加了小鼠支氣管肺泡灌流(BAL)液中的IL-10、TGF-β水平和中性粒細(xì)胞在肺組織中募集。地塞米松降低了炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平,抑制了肺組織中肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)和粘液高分泌。但是,地塞米松并沒(méi)有降低反而增加了肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和與人類(lèi)功能同源的IL-8的水平。體外研究發(fā)現(xiàn),塵螨主要抗原組分Derp1可刺激人肺泡上皮A549細(xì)胞,增強(qiáng)了IL-8的基因表達(dá)和NF-κB的活性。然而,未見(jiàn)地塞米松抑制A549細(xì)胞中升高的IL-8水平,但NF-κB抑制劑BAY11-7082卻降低了IL-8的高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-8水平的增加可能參與類(lèi)固醇拮抗型中性粒細(xì)胞型氣道炎癥,而這種機(jī)制可能與通過(guò)激活NF-κB途徑有關(guān)。脾酪氨酸激酶(Syk)可表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞內(nèi),在急性和慢性炎癥中,通過(guò)細(xì)胞外抗原誘導(dǎo)的IgE受體FcεRI介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是觀察二苯乙烯類(lèi)化合物Vam3對(duì)免疫復(fù)合物誘導(dǎo)炎癥的抑制及其機(jī)制。首先,建立了以Km原理高通量化合物篩選模型,觀察Vam3對(duì)Syk激酶的抑制作用。其次,通過(guò)活化IgE受體FcεRI介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化,評(píng)價(jià)Vamm3在細(xì)胞水平上的抗炎作用。最后,應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)評(píng)價(jià)Vam3對(duì)Syk激酶下游信號(hào)通路的影響。結(jié)果觀察到二苯乙烯類(lèi)化合物Vam3競(jìng)爭(zhēng)性抑制了Syk激酶的催化活性,其Ki和IC50值分別為61.09nM和62.95nM。Vam3在細(xì)胞水平上以劑量依賴(lài)的方式降低了大鼠腹腔肥大細(xì)胞和RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平。同時(shí),Vam3抑制了多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,如腫瘤壞死因子TNF-α,IL-6,IL-8等,其IC50值分別為3.2μM、2.43μM、1.3μM。此外,通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)Vam3能夠抑制Syk蛋白激酶的Y525/526位點(diǎn)、下游分子LAT的Y191位點(diǎn)、cPLA2的S505位點(diǎn)、PLCγ-1的Y783位點(diǎn)和S1248位點(diǎn)的磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了Vam3是通過(guò)抑制Syk的催化活性,導(dǎo)致下游分子LAT、cPLA2、PLCγ-1活化的抑制,進(jìn)而抑制炎癥